研究蛋白質相對定量的蛋白質組學方法

差異蛋白表達的測量為檢測細胞的整體變化提供了一種直接而準確的方法。定量蛋白質組學對于發(fā)現(xiàn)診斷或預后蛋白標志物、檢測新的治療靶點以及了解基本的生物學過程和機制具有重要意義。隨著質譜技術的發(fā)展，我們可以利用更可靠和動態(tài)的方法來分析蛋白質的差異表達。

定量蛋白質組學可分為相對定量和絕對定量。相對定量是研究不同情況下蛋白質組表達的差異，主要方法有穩(wěn)定同位素標記和無標記定量。絕對定量是獲得蛋白質的特定表達水平。以下是相對定量蛋白質組學常用的一些技術。

代謝標記需要在富含培養(yǎng)基的穩(wěn)定同位素中培養(yǎng)樣品。 SILAC（細胞培養(yǎng)中氨基酸的穩(wěn)定同位素標記）依賴于將特定“輕”或“重”形式的氨基酸代謝結合到蛋白質中。經(jīng)過多次細胞分裂后，蛋白質被穩(wěn)定同位素標記。來自“輕”和“重”培養(yǎng)物的蛋白質可以通過質譜一起分析。由于質量差異，質譜中根據(jù)這兩種肽的面積進行相對定量。目前常用的有亮氨酸、精氨酸、賴氨酸等氨基酸。

圖 1. SILAC 的工作流程

除了定量蛋白質的研究外，SILAC技術還用于翻譯后修飾蛋白質的鑒定和修飾，以及蛋白質的相互作用。該技術在處理前引入標簽，因此誤差小，重現(xiàn)性好。然而，SILAC只適用于細胞樣本，而且由于培養(yǎng)細胞需要很長時間。

2. 化學標簽——iTRAQ

引入同位素在體外，適用于細胞、體液、組織等樣品。有幾種代表性方法，例如用于相對和絕對定量的等壓標簽 (iTRAQ) 標記肽 N 端氨基，酯化標記標記肽 C 端羧基 (-COOH)，ICAT 用于半胱氨酸硫醇 (-SH) 和很快。以下重點介紹 iTRAQ。 iTRAQ實驗非常適合比較不同處理中的樣品、生物復制并提供相對定量。

圖 2. iTRAQ 的工作流程

iTRAQ標記定量蛋白質組學由Applied Biosystems Incorporation 開發(fā)，是一種利用多重等壓化學標記試劑的技術。該試劑由報告基團、平衡基團和肽反應基團組成。肽反應基團將 iTRAQ Reagent 同量異位標簽與肽的每個賴氨酸側鏈和 N 末端基團共價連接，標記給定樣品消化物中的所有肽。在 MS/MS 圖中，不同樣品標記中的相同蛋白質表現(xiàn)出相同的質荷比。通過比較 MS/MS 報告離子的峰面積和所得峰比來實現(xiàn)定量。

3. 無標簽

無標記定量技術可以確定兩個或多個樣品中蛋白質的相對量。無標記定量不會將穩(wěn)定同位素引入蛋白質，這與其他蛋白質定量方法不同。

無標記定量技術通常有兩種方式。定量值可以通過提取母離子色譜峰的面積——曲線下面積 (AUC) 或 MS1 信號強度方法來測量。第二個是基于分配給給定蛋白質的光譜數(shù)，稱為光譜計數(shù)。在光譜計數(shù)方法中，來自同一蛋白質的已識別 MS/MS 光譜的數(shù)量與蛋白質豐度直接相關。一般來說，樣品中蛋白質的豐度越高，通過切割產(chǎn)生的肽就越多。并且消化產(chǎn)生的肽越多，質譜鑒定出的唯一匹配肽就越多，對應的光譜數(shù)量也就越多。

蛋白質組學是對細胞或組織表達的所有蛋白質的系統(tǒng)分析，質譜是必不可少的分析工具。質譜法可用于檢測細胞或組織中對外部或內(nèi)部干擾作出反應的蛋白質組的變化，稱為定量蛋白質組學。

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