circRNA pull down * 技術(shù)簡介
目前，circRNA
pull
down技術(shù)絕大部分是基于接口序列設(shè)計探針捕獲circRNA及其結(jié)合蛋白。由于受限于接口處序列特征，很多circRNA無法設(shè)計出理想的探針，最終導致實驗失敗。
我司開發(fā)了一種新型的circRNA pull
down方法（已獲國家知識產(chǎn)權(quán)局發(fā)明專利授權(quán)，專利號：ZL 2021 1 1160837.9），通過構(gòu)建circRNA過表達載體，使circRNA連上一段16nt的短RNA序列標簽（命名為F2），該標簽與其特異性配體具有很強的親和力，因此可利用該系統(tǒng)高效調(diào)取靶RNA序列及其結(jié)合蛋白。最終通過western
blot或LC-MS/MS實驗檢測洗脫液中靶RNA的潛在結(jié)合蛋白，還可通過qPCR實驗檢測能夠結(jié)合靶circRNA的miRNA。
（圖：circRNA pull
down發(fā)明專利證書—輝駿生物）
憑借多年RNA和蛋白研究經(jīng)驗，輝駿生物已掌握先進的 circRNA pull-down 技術(shù)，幫助您識別 miRNA/RBP 和 circRNA 之間的相互作用。每個項目都是完全定制的，以滿足您的科學需求，我們經(jīng)驗豐富的團隊可以為您提供靈活的解決方案，以更快的時間和更低的價格給您最可靠的服務。售后技術(shù)支持將一直保持到文章發(fā)表，確保您安心進行下游實驗及投稿。如果您對circRNA pull-down有任何實驗問題，請隨時與我們聯(lián)系！
circRNA pull-down * 實驗流程
circRNA pull down * 應用背景
環(huán)狀RNA（circRNA）是單鏈共價閉合的RNA分子，廣泛存在于各物種中。據(jù)報道，circRNA可作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、microRNA海綿和蛋白翻譯模板發(fā)揮生物學功能。
除此之外，circRNA還可以結(jié)合蛋白質(zhì)來發(fā)揮作用，如：
與兩種蛋白均相互作用，促進或解離它們之間的相互作用。與一種蛋白相互作用，促進或解離其與另一種蛋白的相互作用。
與一種蛋白（如轉(zhuǎn)錄因子或酶）相互作用，促進或抑制其與靶DNA序列的結(jié)合。與一種蛋白（如調(diào)控mRNA剪接、穩(wěn)定和翻譯的RNA結(jié)合蛋白）相互作用，促進或抑制其與其他RNA的結(jié)合。與一種蛋白相互作用，影響它的胞內(nèi)運輸和定位（如核質(zhì)轉(zhuǎn)運等），進而影響該蛋白的功能。以上這些作用模式又不是相互獨立的，而是可能存在重疊。
由于蛋白質(zhì)是幾乎所有生命活動的直接效應分子，因此研究circRNA與蛋白的相互作用極大地拓展了我們對circRNA功能的認知。
circRNA pull down * 輝駿服務內(nèi)容
| 服務項目 | 服務內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實驗周期 | 客戶提供 | 價格
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circRNA pull-down WB （驗證型） | circRNA-F2載體構(gòu)建和成環(huán)檢測 | 載體質(zhì)粒及測序結(jié)果 qPCR檢測結(jié)果 構(gòu)建和檢測實驗報告 | 3-4周 | 實驗樣本 circRNA序列的質(zhì)粒模板 待測蛋白抗體 實驗信息表 |
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| circRNA-F2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細胞和表達效率檢測 | qPCR檢測結(jié)果 | 5-7周 |
circRNA pull down調(diào)取目標circRNA及其結(jié)合蛋白 | circRNA的qPCR檢測結(jié)果 待測蛋白的Western blot檢測圖 Pull down實驗報告 |
circRNA pull-down MS （篩選型） | circRNA-F2載體構(gòu)建和成環(huán)檢測 | 載體質(zhì)粒及測序結(jié)果 qPCR檢測結(jié)果 構(gòu)建和檢測實驗報告 | 3-4周 | 實驗樣本 circRNA序列的質(zhì)粒模板 實驗信息表 |
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| circRNA-F2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染目的細胞和表達效率檢測 | qPCR檢測結(jié)果 | 7-8周 |
circRNA pull down調(diào)取目標circRNA及其結(jié)合蛋白 | circRNA的qPCR檢測結(jié)果
蛋白SDS-PAGE銀染檢測圖 Pull down實驗報告 |
| LC-MS/MS檢測和數(shù)據(jù)分析 | 質(zhì)譜檢測結(jié)果及報告 互作蛋白篩選表格 生物信息學分析結(jié)果和報告 |
circRNA pull down * 樣本要求
樣本類型
| circRNA pull down WB建議送樣量 | circRNA pull down MS建議送樣量 |
動物細胞
| 3*10e7個細胞/組（約3個10cm皿） | 5*10e7個細胞/組（約5個10cm皿） |
▲注意：以上均為每組樣本的送樣量，如果實驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細送樣指南可聯(lián)系輝駿生物索取。
保存及運輸：-80℃保存，干冰取樣/運輸，至少在送樣前2天通知我司。
circRNA pull down * 結(jié)果示例
circRNA成環(huán)檢測（qPCR）
circRNA調(diào)取效率檢測（qPCR）
RNA pull down WB檢測圖（陽性）
RNA pull down MS質(zhì)譜檢索表格（部分展示）
實驗組獨有蛋白（潛在結(jié)合蛋白）的生物信息學分析結(jié)果示例
circRNA pull down * 文章解析
Wang L.Y. Circular RNA circRHOT1 promotes hepatocellular carcinoma progression by initiation of NR2F6 expression.
Molecular Cancer. 2019. (IF= 27.401).
circRHOT1通過激活NR2F6促進肝細胞癌進程
研究概述
利用在線數(shù)據(jù)庫對肝細胞癌(HCC)組織和癌旁組織的circRNA表達水平分析顯示，circRHOT1是在HCC中上調(diào)很明顯的一種保守性的circRNA，因此作者以circRHOT1為對象研究了其在HCC中的作用機制。iegcircRHOT1通過募集TIP60蛋白到NR2F6啟動子來促進其表達，進而促進HCC進程。circRHOT1和NR2F6是HCC預后的潛在生物標志物，但由于在HCC患者中抑制circRHOT1較為困難，因此藥理學上抑制NR2F6可能更有希望。
研究路線
Northern印跡、qRT-PCR、原位雜交等實驗確認了circRHOT1在HCC組織中高表達
體內(nèi)和體外實驗證明circRHOT1促進HCC增殖、遷移和侵襲
RNA-seq等技術(shù)分析了circRHOT1缺失后的差異表達基因，其中NR2F6下調(diào)最多
CHIRP實驗發(fā)現(xiàn)circRHOT1富集在NR2F6啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點
ChIP-qPCR等實驗顯示敲除circRHOT1影響了NR2F6啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點組蛋白修飾，且RNA聚合酶II不能再結(jié)合該啟動子，circRHOT1促進NR2F6轉(zhuǎn)錄
ChIP和基因表達實驗表明circRHOT1對PIP60介導的NR2F6表達至關(guān)重要
表達和功能檢測發(fā)現(xiàn)NR2F6在腫瘤組織中上調(diào)，且促進HCC增殖、遷移和侵襲，circRHOT1通過激活NR2F6促進HCC進程
circRNA pull-down * 輝駿服務優(yōu)勢
該親和純化系統(tǒng)為輝駿生物自主研發(fā)，F(xiàn)2與配體具有超強親和力，能高效調(diào)取circRNA及其結(jié)合蛋白，且捕獲特異性更強。F2標簽跨circRNA接口設(shè)計，可以有效去除線性基因的背景干擾該pull down系統(tǒng)不受限于circRNA接口處序列，適用范圍更廣自有分子、細胞、蛋白檢測實驗平臺，能有效指定并執(zhí)行最優(yōu)實驗路線，對微量蛋白鑒定有十足把控力售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M行下游實驗及投稿
輝駿實力
實驗熱線：4006991663
