中文標(biāo)題：捕獲新轉(zhuǎn)錄RNA的相互作用體，或促進(jìn)對(duì)不同細(xì)胞和系統(tǒng)中總RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的深入研究
發(fā)表期刊：Nature Methods
影響因子：28.467
合作單位：中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)學(xué)與健康研究所
運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持）
● 研究背景
目前系統(tǒng)研究RNA結(jié)合蛋白質(zhì)組的方法主要是基于捕獲多聚腺苷酸(PolyA)RNA，主要是帶有寡聚(DT)包被珠的mRNA。然而PolyA尾巴只在新轉(zhuǎn)錄的RNA成熟的過程中被添加到RNA中，而一些成熟的mRNA要么是非PolyA的，要么是雙態(tài)的。此外，成熟的非PolyA
RNA物種占所有轉(zhuǎn)錄序列的很大一部分。捕獲與所有類型RNA相互作用的RNA結(jié)合蛋白的方法不僅可以擴(kuò)大我們目前對(duì)RNA相互作用組的看法，而且有助于理解非Polya
RNA在生理和疾病中的功能。
● 研究結(jié)果
1. 利用RICK技術(shù)捕獲新轉(zhuǎn)錄的RNA互作組
研究者用Eu標(biāo)記HeLa細(xì)胞中的RNA，固定細(xì)胞后通過點(diǎn)擊反應(yīng)使Eu生物素化，然后用鏈霉親和素包裹的珠子提取RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物。凝膠電泳和銀染證實(shí)Rick方法成功分離出與EU標(biāo)記RNA直接相互作用的蛋白質(zhì)。Western
blotting驗(yàn)證了Rick對(duì)已知RNA相關(guān)蛋白的捕獲。
圖1
2. Rick捕獲的RNA種類
研究者對(duì)Rick
pull
down樣本進(jìn)行了RNA測(cè)序(RNA-seq)，分析結(jié)果(圖2A)與Castello的oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)相比顯示出明顯的差異，在該數(shù)據(jù)中，捕獲的RNA中80%是mRNA。接下來，研究者研究了Rick樣本中的富集與三種相關(guān)的非PolyA
RNA：CircRNA、近端啟動(dòng)子RNA(ppRNA)和增強(qiáng)子RNA(ERNA)的oligo(Dt)捕獲情況。在對(duì)ppRNA的評(píng)估中，與oligo(Dt)捕獲相比，Rick樣本中轉(zhuǎn)錄暫?；?TR>4)在TSS周圍積累了更高的RNA-seq信號(hào)，這表明僅通過Rick就能有效地分離ppRNA；而非暫?；?TR<4)差異則很小(圖2B，C)。此外，在Rick樣本中，RNA-seq信號(hào)在假定的增強(qiáng)子區(qū)域16(6.05%)上有很強(qiáng)的富集，而在寡核苷酸(DT)捕獲中幾乎沒有(0.11%)(圖2D)。RT-qPCR進(jìn)一步證實(shí)，與oligo(Dt)捕獲相比，用Rick提取的非Polya
RNA分離效果良好。簡(jiǎn)言之，除Polya
RNA外，Rick還成功地分離出了其他各種RNA種類，表明它也可以富集不是通過寡核苷酸(DT)捕獲方法分離的相關(guān)結(jié)合蛋白。
圖2
3. RICK法分離蛋白質(zhì)的特性研究
采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)對(duì)Rick分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。與oligo(DT)捕獲在不同條件下的比較表明，Rick分離了許多在oligo(DT)捕獲研究中沒有鑒定到的蛋白質(zhì)）（圖3B），這些差異既不是由于細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白質(zhì)組學(xué)程序的差異，也不是由Eu標(biāo)記引起的（圖3A）。
圖3
4. RICK分離蛋白的功能分析
對(duì)295個(gè)RICK特有的RBP進(jìn)行了GO分析，觀察了與有絲分裂相關(guān)的生物過程的富集(圖4A)。KEGG途徑分析還將“細(xì)胞周期”列為前十個(gè)最顯著富集的途徑（圖4B）。相反，對(duì)Rick鑒定的425種蛋白質(zhì)進(jìn)行的GO和KEGG分析顯示，oligo（dT）捕獲數(shù)據(jù)集中存在的蛋白質(zhì)主要與RNA相關(guān)。綜上所述，這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步加強(qiáng)了Rick在分離用寡核苷酸(DT)捕獲方法未鑒定出的蛋白質(zhì)方面的獨(dú)特性，并揭示了RNA在意想不到的細(xì)胞過程中的功能。
圖4
5. RICK識(shí)別與非polyA RNA優(yōu)先結(jié)合的蛋白質(zhì)
考慮到通過Rick和oligo(DT)捕獲分離的RNA種類的顯著差異，295個(gè)RICK特有的RBP中有相當(dāng)一部分可能優(yōu)先與非polyA
RNA結(jié)合。這種特異性可能是由于化學(xué)計(jì)量學(xué)、亞細(xì)胞定位或潛在的內(nèi)在結(jié)合特異性。LC-MS/MS鑒定出914個(gè)高置信度蛋白質(zhì)，稱之為“PolyA缺失型Rick蛋白”。在這914個(gè)蛋白質(zhì)中，576個(gè)與標(biāo)準(zhǔn)Rick程序的720個(gè)高置信度蛋白質(zhì)重疊(圖5A)。進(jìn)一步分析表明，295個(gè)RICK特有的RBP中有204個(gè)(69.2%)與914個(gè)PolyA缺失型Rick蛋白重疊(圖5B)。此外，在710個(gè)與RICK特有RBP不重疊的710個(gè)polyA缺失型RICK蛋白中，有563個(gè)出現(xiàn)在oligo(DT)捕獲數(shù)據(jù)集中(圖5B)，這表明這些蛋白具有結(jié)合PolyA和非PolyA
RNA的混合趨勢(shì)。這些結(jié)果表明，Rick可用于鑒定優(yōu)先與非Polya RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。
圖5
6. 與METTL1和CDK1相互作用的RNA特性
我們選擇了兩個(gè)Rick特有的RBP
METTL1和CDK1，用PAR-CLIP測(cè)序方法研究了它們相互作用的RNA。METTL1的兩個(gè)獨(dú)立PAR-CLIP測(cè)序?qū)嶒?yàn)顯示捕獲的RNA存在廣泛重疊，其中很大一部分也被RICK捕獲。進(jìn)一步分析證實(shí)METTL1與tRNA顯著結(jié)合，還與多種推測(cè)為非polyA的RNA結(jié)合，如內(nèi)含子RNA和從基因間區(qū)域轉(zhuǎn)錄的RNA（圖5C）。接下來，研究者使用隨機(jī)六聚體或寡聚體（dT）引物進(jìn)行RNA免疫沉淀（RIP），然后進(jìn)行RT-qPCR，以識(shí)別METTL1靶RNA是否具有polyA尾巴。RIP-qPCR顯示，使用隨機(jī)六聚體富集了7個(gè)mRNA，而使用寡聚(DT)引物只能擴(kuò)增出其中的3個(gè)，證實(shí)了METTL1與含有mRNA序列的非PolyA
RNA結(jié)合(圖5D)。CDK1
PAR-CLIP測(cè)序分析顯示與轉(zhuǎn)錄自基因間區(qū)域和內(nèi)含子RNA的RNA結(jié)合，與RICK捕獲的RNA也存在廣泛重疊。后續(xù)分析進(jìn)一步表明，METTL1和CDK1廣泛地與非PolyA
RNA結(jié)合，暗示這兩種蛋白的RNA相關(guān)功能被忽視。
7. 利用RICK捕獲新生RNA互作組
研究者對(duì)HeLa細(xì)胞進(jìn)行了短Eu標(biāo)記(0.5、1和2小時(shí))，以研究Rick是否可以捕獲與新生RNA互作的蛋白。鑒定了208種不同的高置信度蛋白質(zhì)(分別為149、119和143，作用時(shí)間分別為0.5、1和2小時(shí))，稱之為“新生富集RBP”和319種低置信度蛋白質(zhì)(圖6A)。對(duì)208個(gè)新生富集RBP進(jìn)行的GO和KEGG通路分析顯示，轉(zhuǎn)錄和RNA代謝相關(guān)術(shù)語顯著豐富(圖6B)。進(jìn)一步的研究表明，新生RNA轉(zhuǎn)錄和局部代謝物產(chǎn)生之間存在聯(lián)系，從而調(diào)節(jié)表觀基因和潛在的表觀轉(zhuǎn)錄基因。
圖6
8. 利用RICK獲取mESC總RNA互作組
為證明Rick可以應(yīng)用于其他類型的細(xì)胞，研究者用鏈霉親和素結(jié)合辣根過氧化物酶證實(shí)了Eu在mESC中的有效摻入，并進(jìn)行了LC-MS/MS，鑒定出518個(gè)高置信蛋白和304個(gè)低置信蛋白。這518個(gè)高置信度蛋白質(zhì)中有160個(gè)與Kwon等人報(bào)告的“mESC
mRNA相互作用組”重疊，而358個(gè)是RICK獨(dú)有的，因此將其稱為RICK獨(dú)有的mESC
RBP。對(duì)這358個(gè)候選限制性商業(yè)慣例的GO分析顯示，RNA結(jié)合或PolyA
RNA結(jié)合術(shù)語豐富。在這358個(gè)蛋白中，有95個(gè)在mESC中的表達(dá)水平高于分化后的細(xì)胞，這表明mESC在自我更新或多能性方面具有潛在的作用。因此，Rick可以應(yīng)用于HeLa以外的不同細(xì)胞類型；此外還需要進(jìn)一步的研究來確定新發(fā)現(xiàn)的候選RBP在mESC自我更新/多能性中的作用。
4899+客戶已添加微信獲取實(shí)驗(yàn)優(yōu)惠！
實(shí)驗(yàn)熱線：4006991663
