RNA免疫沉淀（RIP）* 實(shí)驗原理
RIP（RNA Binding Protein Immunoprecipitation, RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀）是研究體內(nèi) RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。
結(jié)合了抗體的磁珠或樹脂（Beads）與樣本裂解液孵育，通過”抗原-抗體“之間的免疫作用，誘餌蛋白被吸附在Beads上，與誘餌蛋白結(jié)合的RNA，也一起沉淀到Beads上。洗滌去掉未結(jié)合的RNA后，再用洗脫液將RNA-蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來，便得到RNA免疫沉淀產(chǎn)物。RIP產(chǎn)物既可以用qPCR檢測已知RNA，也可以用二代測序檢測未知RNA。
當(dāng)沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達(dá)融合了flag標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用flag標(biāo)簽做免疫沉淀。即細(xì)胞過表達(dá)Flag-Bait，經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合，與誘餌融合蛋白互作的RNA“共沉淀”到Beads上，再經(jīng)洗滌、洗脫后做qPCR或NGS測序。
輝駿生物10年科研服務(wù)經(jīng)驗，專業(yè)提供分子互作實(shí)驗服務(wù)，包括蛋白與蛋白、蛋白與DNA、蛋白與RNA、RNA與RNA的相互作用技術(shù)，經(jīng)驗豐富，實(shí)驗結(jié)果穩(wěn)定、可靠。
我公司自有分子、細(xì)胞和質(zhì)譜實(shí)驗平臺，能執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗路線，對微量互作蛋白的質(zhì)譜鑒定有充足把控力，對后續(xù)功能分析有獨(dú)到見解。
我們不僅會提供專業(yè)的售前方案建議、而且售后技術(shù)支持將一直保持到文章發(fā)表，確保您安心進(jìn)行下游實(shí)驗及投稿。
目前，客戶已在Nature子刊、Oncogene、Cell Research等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章（點(diǎn)擊查看客戶文獻(xiàn)）。
RNA免疫沉淀（RIP）* 實(shí)驗流程
內(nèi)源蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖
標(biāo)簽融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖
RNA免疫共沉淀（RIP）* 應(yīng)用背景
RNA結(jié)合蛋白（RNA binding protein，RBP）是一類功能強(qiáng)大而廣泛的調(diào)節(jié)因子，約占細(xì)胞編碼的所有蛋白的5%~10%。目前除了少數(shù)RNA以核酶形式單獨(dú)發(fā)揮功能，大部分RNA通過與蛋白結(jié)合形成RNA-蛋白復(fù)合物來發(fā)揮作用。
一方面，RBP參與RNA合成、可變剪接、修飾、轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯及胞內(nèi)定位等多個轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程，調(diào)控mRNA穩(wěn)定性、lncRNA活性、miRNA沉默復(fù)合體形成等生物學(xué)過程；另一方面，RNA也會調(diào)節(jié)這些蛋白質(zhì)的活性、定位或與其他蛋白質(zhì)的相互作用，從而影響RBP介導(dǎo)的各種細(xì)胞事件。RNA與蛋白質(zhì)的相互作用對于維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)是非常重要的，干擾這種相互作用將會導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào)和相關(guān)疾病的發(fā)生。
目前研究RNA-蛋白質(zhì)相互作用的方法分為兩大類：一是以感興趣的RNA為中心，尋找與該RNA結(jié)合的蛋白質(zhì)；二是以感興趣的蛋白質(zhì)為中心，尋找與該蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA。RIP（RNA免疫共沉淀）屬于后者，利用特異性的抗體捕獲樣本中的目標(biāo)蛋白，那么與目標(biāo)蛋白結(jié)合的RNA也一并被捕獲，之后通過qPCR或者測序技術(shù)來確定這些結(jié)合的RNA。
RNA免疫共沉淀（RIP）* 輝駿服務(wù)內(nèi)容
服務(wù)項目
| 服務(wù)內(nèi)容 | 結(jié)果交付 | 實(shí)驗周期 | 客戶提供 | 價格
|
RIP qPCR （驗證型） | Western blot檢測樣本（input）中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 5-6周 | 實(shí)驗樣本 誘餌蛋白的IP級抗體 實(shí)驗信息表（樣本信息，誘餌蛋白序列） |
|
RIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的RNA （2組：實(shí)驗組和對照組） | 誘餌蛋白Western blot檢測圖
待測RNA的qPCR檢測數(shù)據(jù) RIP實(shí)驗報告 |
RIP seq （篩選型） | Western blot檢測樣本（input）中的誘餌蛋白 | Western blot檢測圖 | 5-6周 | 實(shí)驗樣本 誘餌蛋白的IP級抗體 實(shí)驗信息表（樣本信息，誘餌蛋白序列） |
|
RIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的RNA （2組：實(shí)驗組和對照組） | 誘餌蛋白Western blot檢測圖
RIP實(shí)驗報告 |
seq檢測和分析 （2組：實(shí)驗組和input） | seq檢測結(jié)果 檢測和分析報告 | 9周
|
RNA免疫共沉淀RIP * 樣本要求
樣本類型
| RIP-qPCR 建議送樣量 | RIP-seq 建議送樣量 |
| 動物細(xì)胞 | 3*10e7個細(xì)胞/組（約3個10cm皿） | 5*10e7個細(xì)胞/組（約5個10cm皿） |
| 動物組織 | 1g/組 | 2g/組 |
| 植物葉片 | 2g/組 | 4g/組 |
| 植物根或果實(shí) | 4g/組 | 8g/組 |
| 菌體 | 50ul菌體沉淀/組 | 100ul菌體沉淀/組 |
▲注意：這里列出的均為每組樣本的送樣量，如果實(shí)驗和對照組用的樣本一致，此樣本量*2。詳細(xì)送樣指南可聯(lián)系輝駿生物客服或銷售索取。
保存及運(yùn)輸：-80℃保存，干冰取樣/運(yùn)輸，至少在送樣前2天通知我司。
RNA免疫共沉淀RIP * 結(jié)果示例
RIP-qPCR：誘餌蛋白western blot檢測圖
Normalized to Input | GAPDH | B基因-引物1 | B基因-引物2 |
| Input | 1
| 1 | 1 |
| IgG_RIP | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
| A蛋白_RIP | 0.00% | 0.90% | 0.78% |
Normalized to IgG | GAPDH | B基因-引物1 | B基因-引物2 |
| IgG_RIP | 1 | 1 | 1 |
| A蛋白_RIP | 3.053 | 241.241
| 314.227 |
RIP-qPCR：待測基因和內(nèi)參基因檢測數(shù)據(jù)
RIP組相對于IgG組的富集圖
RNA免疫共沉淀RIP * 客戶服務(wù)案例
Han H. et al: Long noncoding RNA PART1 restrains aggressive gastric cancer through the epigenetic silencing of PDGFB via the PLZF-mediated recruitment of EZH2.
Oncogene. 2020. (IF=9.867)
lncRNA PART1通過PLZF介導(dǎo)的EZH2募集導(dǎo)致PDGFB表觀遺傳沉默來抑制侵襲性胃癌
研究概述
以往研究顯示，一種長鏈非編碼RNA(LncRNA)“PART1”在某些癌癥中有抑癌作用，在某些癌癥中又有致癌作用。人類胃癌組織的GEO芯片數(shù)據(jù)顯示，lncRNA PART1在胃癌中顯著下調(diào)，TCGA數(shù)據(jù)庫和GEPIA數(shù)據(jù)庫信息顯示低水平的lncRNA PART1更容易導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移和患者生存期縮短；但其臨床意義和潛在機(jī)制尚未明確。本研究發(fā)現(xiàn)的PART1新作用機(jī)制是：PART1與AR相互作用，以雄激素非依賴性的模式激活腫瘤抑制因子PLZF，之后PLZF蛋白和EZH2蛋白相互作用，導(dǎo)致PI3K-Akt通路基因PDGFB的啟動子發(fā)生H3K27me3修飾，從而使促癌基因PDGFB的轉(zhuǎn)錄活性受到抑制。
研究路線
細(xì)胞、CAM和小鼠實(shí)驗均表明PART1水平與胃癌的惡性程度、轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)RNA-seq實(shí)驗發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的PART1下調(diào)了PI3K-Akt通路的一些基因，上調(diào)了腫瘤抑制基因PLZF，腫瘤組織檢測和TCGA數(shù)據(jù)庫資料確定了該結(jié)果RNA pulldown結(jié)合質(zhì)譜鑒走技術(shù)首次發(fā)現(xiàn)了PART1的潛在結(jié)合蛋白——AR(已有研究表明AR可以激活前列腺瘟中的PLZF并抑制其增殖ChIP和雙熒光素酶實(shí)驗表明AR與PLZF啟動子的2個位點(diǎn)結(jié)合，PLZF啟動子因AR、PART1的單獨(dú)作用或兩者的協(xié)同作用而激活數(shù)據(jù)庫調(diào)查和Co-IP結(jié)果均顯示PIZF蛋白與EZH2蛋白結(jié)合ChIP-qPCR結(jié)果表明PI3K-Akt通路蛋白PDGFB的啟動子與PIZF、EZH2蛋白結(jié)合、且該區(qū)域發(fā)生H3K27me3修飾功能回復(fù)實(shí)驗表明， PDGFB過表達(dá)可以部分回復(fù)PART1對GC細(xì)胞生長、遷移和侵襲、等能力的抑制
RNA免疫共沉淀RIP * 客戶文章
 | 3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756. 【研究內(nèi)容】：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實(shí)驗發(fā)現(xiàn)：circVPRBP與OGT酶競爭結(jié)合RACK1蛋白，阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來使其降解，從而抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。 使用相關(guān)技術(shù)：RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質(zhì)譜鑒定 |
實(shí)驗熱線：4006991663
