蛋白質(zhì)豐度對(duì)于免疫沉淀至關(guān)重要

在免疫沉淀 (IP) 過(guò)程中，感興趣的蛋白質(zhì) (POI) 被結(jié)合到珠子（如瓊脂糖或磁性瓊脂糖）上的特定抗體或納米抗體拉下，通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的樣品內(nèi)容物，例如其他蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片和脂質(zhì)，而沉淀的蛋白質(zhì)在珠子上富集，對(duì)于成功的 IP，POI 的豐度或表達(dá)水平至關(guān)重要；  不幸的是，這經(jīng)常被遺忘，如果 POI 表達(dá)強(qiáng)烈且豐富，那么 IP 很可能是直截了當(dāng)?shù)模瑳](méi)有任何困難。   但是，如果 POI 以低豐度或表達(dá)水平存在，則可能需要優(yōu)化 IP 協(xié)議。

以下是輝駿生物介紹如何成功免疫沉淀低豐度 POI 的一些方法和技巧：

A. 使用具有高親和力的抗體或納米抗體

使用高親和力、低解離常數(shù) K D 納米抗體可有效下拉少量 POI。 這是因?yàn)?，根?jù)穩(wěn)態(tài)結(jié)合方程，當(dāng) POI 的濃度等于 K D 。 因此，理想情況下，POI 的濃度應(yīng)超過(guò)用于 IP 的抗體/納米抗體的 K D ，以結(jié)合盡可能多的 POI 并保持未結(jié)合 POI 的量盡可能低。 如果抗體的親和力太低，解離常數(shù)太高，雖然 POI 存在于細(xì)胞裂解物中，但可能不會(huì)沉淀，這可能導(dǎo)致 IP 假陰性結(jié)果。

幸運(yùn)的是，對(duì)于許多納米抗體來(lái)說(shuō)，高親和力和高特異性齊頭并進(jìn)，確保細(xì)胞蛋白的低背景，這是低豐度蛋白 IP 的先決條件。

B. 增加 POI 的濃度

如果無(wú)法增加 POI 的豐度或表達(dá)水平，則可以使用以下提示和技巧增加其在測(cè)定中的濃度：

1. 使用更多細(xì)胞或組合幾個(gè)細(xì)胞沉淀來(lái)制備細(xì)胞裂解物。

2. 不要向細(xì)胞裂解液中添加稀釋緩沖液或僅添加少量緩沖液。

注意：仍然建議使用 500 μL 細(xì)胞裂解液和 25 μL GFP-Trap 漿液。

注意：可能需要更頻繁和/或更劇烈的清洗，用 20-50 μL 2x SDS 樣品緩沖液洗脫，并嘗試在 SDS-PAGE/WB 上加載盡可能多的洗脫部分。

C. 放大WB中POI的信號(hào)

如果洗脫部分中的 POI 量非常低，即使 IP 成功，它也可能不足以進(jìn)行 WB 檢測(cè)。  在這種情況下，建議放大 POI 的 WB 信號(hào)。  當(dāng)多克隆一抗與多克隆二抗組合用于 WB 檢測(cè)時(shí)，可獲得最高的信號(hào)放大。

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