SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 技術(shù)原理

SILAC(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture)是一種細(xì)胞培養(yǎng)條件下的穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)。利用含輕、中或重型同位素標(biāo)記的必需氨基酸（主要是賴氨酸Lys和精氨酸Arg）培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)新合成的蛋白質(zhì)，培養(yǎng)7代以上，細(xì)胞中幾乎所有蛋白質(zhì)都被標(biāo)記。等量混合各類型蛋白質(zhì),酶解后進(jìn)行LC-MS/MS分析，即可得到肽段及蛋白的定性和相對定量結(jié)果。

SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 實(shí)驗(yàn)流程

SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 技術(shù)應(yīng)用

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)：疾病標(biāo)志物，發(fā)病機(jī)制，疾病分型等；

生物醫(yī)藥：藥物機(jī)理，藥效評價(jià)，藥物開發(fā)等；

SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 輝駿服務(wù)優(yōu)勢

1

近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn)，眾多服務(wù)案例，服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可

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對蛋白篩選與定量方面有獨(dú)到見解，擅長針對客戶情況提出合適的方案建議

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自有分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)平臺，能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線

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售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿

聯(lián)系技術(shù)支持

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SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 服務(wù)信息

SILAC蛋白質(zhì)組學(xué) * 客戶文章

1. Gu C.M. et al: Discovery of the Oncogenic Parp1, a Target of bcr-abl and a Potential Therapeutic, in mir-181a/PPFIA1 Signaling Pathway. Molecular Therapy: Nucleic Acids. 2019，IF= 5.66. 【研究內(nèi)容】：miR-181a在白血病特別是慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）中表達(dá)下調(diào)，并影響疾病發(fā)展、耐藥性和預(yù)后，但其靶基因的分子機(jī)制尚不清楚。該文章通過基因芯片，SILAC蛋白組學(xué)等方法聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)PPFIA1是miR-181a的直接靶基因。CoIP-MS等后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PARP1會結(jié)合PPFIA1，抑制PPFIA1或PARP1能夠下調(diào)c-KIT水平，抑制CML細(xì)胞生長，并延長小鼠存活期。研究揭示PPFIA1和PARP1或成為潛在的CML治療靶點(diǎn)。 使用技術(shù)：穩(wěn)定同位素標(biāo)記（SILAC）蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)、silac蛋白組、silac標(biāo)記定量實(shí)驗(yàn)服務(wù)

2. Guo, H.C. et al: Quantitative Proteomic Analysis of BHK-21 Cells Infected with Foot-and-Mouth Disease Virus Serotype Asia 1. PLoS ONE. 2015，IF=3.569. 【研究內(nèi)容】：研究者通過穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(SILAC)定量研究了亞洲1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21細(xì)胞后宿主細(xì)胞基因表達(dá)的變化，從結(jié)果中選擇6個(gè)變化顯著的蛋白（其中VPS28、PKR、EVI5為下調(diào)，LYPLA1、SEC62和DARS為上調(diào)）做進(jìn)一步研究。Western blot、RT-PCR等試驗(yàn)驗(yàn)證了這些蛋白在口蹄疫病毒復(fù)制過程中的功能重要性，提示口蹄疫病毒感染可能通過影響細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，為口蹄疫病毒感染創(chuàng)造更有利的條件。 使用技術(shù)：SILAC蛋白質(zhì)組學(xué)分析、SILAC實(shí)驗(yàn)、silac蛋白組檢測外包

3. Fan, H. et al. Quantitative proteomics using stable isotope labeling with amino acids in cell culture reveals protein and pathway regulation in porcine circovirus type 2 infected PK-15 cells. J Proteome Res. 2012，IF=4.564. 【研究內(nèi)容】：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒病(PCVD)的主要病原。為揭示PCV2的致病機(jī)制和病毒與宿主的相互作用，研究者采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)結(jié)合LC-?MS/MS技術(shù)，對PCV2感染的PK-15細(xì)胞進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，并構(gòu)建了PCV2感染的PK-15細(xì)胞的蛋白質(zhì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究有助于理解PCV2感染的致病機(jī)制和宿主細(xì)胞的分子反應(yīng)，為預(yù)防PCV2感染提供新的方法。 使用技術(shù)：質(zhì)譜 silac實(shí)驗(yàn)、silac實(shí)驗(yàn)服務(wù)

蛋白組/代謝組實(shí)驗(yàn)

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實(shí)驗(yàn)檢測服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

? miRNA靶基因驗(yàn)證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

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輝駿實(shí)力

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中文標(biāo)題：在mir-181a/PPFIA1信號通路中發(fā)現(xiàn)致癌的PARP1，或成為BCR-ABL的靶點(diǎn)并有著潛在的治療作用

發(fā)表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

影響因子：7.032

發(fā)表時(shí)間：2019年

合作單位：暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院

運(yùn)用技術(shù)：SILAC定量蛋白質(zhì)組學(xué)（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種克隆性骨髓增生性疾病，每10萬人中約有1-2人，占成人白血病總數(shù)的15%。MIR-181a在白血病中表達(dá)下調(diào)，并影響其進(jìn)展、耐藥性和預(yù)后，然而，其靶點(diǎn)在白血病，特別是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中的確切作用機(jī)制尚不清楚。

● 研究路線

● 研究結(jié)果

1.     MiR-181a在CM中的直接靶基因PPFIA1

為了確定miR-181a在健康血細(xì)胞、人類CML樣本和CML細(xì)胞系中的表達(dá)水平，研究者首先提取了總RNA，并進(jìn)行了qPCR分析。結(jié)果顯示，miR181a在人CML樣本和CML細(xì)胞系中的表達(dá)低于其在健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中的表達(dá)(圖1A)，表明miR-181a的下調(diào)可能在白血病發(fā)生中起重要作用。接下來，研究者將SILAC-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)和基因芯片分析相結(jié)合，系統(tǒng)地研究了miR-181a過表達(dá)對CML細(xì)胞株K562的影響(圖1C)。SILAC-LC-MS/MS分析表明，重新導(dǎo)入miR181a后，K562細(xì)胞中有6000多個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)。然后，用miR-181a模擬物及陰性對照(NC)轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后進(jìn)行基因芯片分析，發(fā)現(xiàn)miR-181a模擬轉(zhuǎn)染組有1500多個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。為了進(jìn)一步篩選K562細(xì)胞中miR-181a的潛在靶點(diǎn)，研究者結(jié)合miRNA預(yù)測、SILAC-LCMS/MS和基因芯片方法，確定了15個(gè)候選miR-181a靶基因。其中，PPFIA1被選作進(jìn)一步分析(圖1D和1E)。

RT-PCR檢測miR-181a是否能下調(diào)K562細(xì)胞中PPFIA1mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物RNA或PPFIA1小干擾RNA(SiRNA)的K562細(xì)胞的PPFIA1mRNA水平明顯低于陰性對照組。隨后，WB檢測miR-181a對PPFIA1蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，MiR-181a和PPFIA1-siRNA的過表達(dá)導(dǎo)致PPFIA1蛋白水平降低(圖1F)。為了確定PPFIA1的3’UTR是否含有功能性miR-181a靶序列，以及這些序列與miR-181a之間是否發(fā)生了直接相互作用，研究者進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告分析。結(jié)果如圖1G所示，在293T細(xì)胞中，miR-181a轉(zhuǎn)染可顯著降低psi-Check-PPFIA1-3’UTR的熒光素酶活性，但不能顯著降低psi-CHECKPPFIA1-MUT-3’UTR的熒光素酶活性。這些結(jié)果表明，PPFIA1可能是K562細(xì)胞中miR-181a的直接靶點(diǎn)。

圖1

2. PPFIA1或miR-181a在慢性粒細(xì)胞白血病惡性進(jìn)展中的作用

接下來，研究者比較了慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞和外周血單個(gè)核細(xì)胞中PPFIA1mRNA的水平。結(jié)果如圖1B所示，受試CML細(xì)胞和人CML樣本中PPFIA1水平較高。接下來，研究者分別在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染PPFIA1 siRNA和miR-181a模擬物，結(jié)果顯示，MiR-181a轉(zhuǎn)染組和PPFIA1 siRNA轉(zhuǎn)染組均以濃度依賴的方式有效增加K562細(xì)胞對IM處理的敏感性(圖2A)。Transwell分析還顯示，經(jīng)miR-181a模擬或PPFIA1 siRNA處理后，CML細(xì)胞的侵襲能力顯著降低(圖2B)。最后，轉(zhuǎn)染miR-181a模擬物和PPFIA1 siRNA的K562細(xì)胞集落形成能力均明顯低于NC組(圖2C)。

為了探討PPFIA1在CML中的高表達(dá)是否與療效有關(guān)，研究者用四甲基偶氮唑鹽比色法分析了IM作用48h后過表達(dá)PPFIA1的K562細(xì)胞對IM的敏感性，結(jié)果顯示過表達(dá)PPFIA1明顯抑制IM對K562細(xì)胞的殺傷作用，表現(xiàn)為細(xì)胞存活率增加(圖2D)。Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PPFIA1過表達(dá)顯著增強(qiáng)了細(xì)胞侵襲力(圖2E)?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，過表達(dá)PPFIA1的K562細(xì)胞集落數(shù)顯著高于對照組(圖2E)。這些結(jié)果表明，PPFIA1和miR-181a的表達(dá)水平與K562細(xì)胞的惡性表型相關(guān)。

圖2

3. PPFIA1 siRNA對CML異種移植小鼠模型的抑制作用

為了探討PPFIA1-siRNA靶向PPFIA1的治療潛力，研究者將106個(gè)熒光素酶標(biāo)記的K562細(xì)胞注射到NSG小鼠體內(nèi)，并通過生物成像監(jiān)測siRNA治療的效果。結(jié)果顯示，與NC siRNA處理組和賦形劑對照組相比，PPFIA1 siRNA顯著抑制K562-熒光素酶細(xì)胞的生長(圖3A)；相對熒光素酶水平如圖3B所示，在接種腫瘤時(shí)，接受NC-siRNA治療的小鼠的相對熒光素酶水平為1.58e+6，然后在第21天上升到8.01e+8，而在接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠中，其相對熒光素酶水平從1.56e+6上升到1.35e+8。這些結(jié)果表明，靶向PPFIA1的PPFIA1-siRNA可以抑制K562-熒光素酶細(xì)胞在體內(nèi)的生長。而體重體重作為動物模型癌癥惡病質(zhì)的重要指標(biāo)，在腫瘤接種時(shí)接受NC-siRNA治療的小鼠的平均體重為27.9g，在第21天下降到26.4g，而接受PPFIA1-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g增加到28.4g(圖3C)。接受PPFIA1 siRNA處理的NSG小鼠比使用NC-siRNA和空白對照組的小鼠存活時(shí)間更長(圖3D)。這些結(jié)果表明，PPFIA1 siRNA可能是治療CML的一種有前途的藥物。

圖3

4. 通過磷酸陣列分析檢測到PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

為了了解PPFIA1增強(qiáng)CML細(xì)胞侵襲性和克隆原性的機(jī)制，研究者進(jìn)行了磷酸陣列檢測，通過計(jì)算兩個(gè)樣品(PPFIA1-siRNA/NC和miR-181a mimic/NC)在248個(gè)位點(diǎn)特異的磷酸化位點(diǎn)上的磷酸化比率確定兩者之間的差異(圖4A)。在miR-181a模擬轉(zhuǎn)染組中，23個(gè)蛋白位點(diǎn)的磷酸化水平降低，其中7個(gè)位點(diǎn)與NC轉(zhuǎn)染組相比降低了30%(圖4B)。PPFIA1 siRNA轉(zhuǎn)染降低了60個(gè)蛋白位點(diǎn)的磷酸化，其中8個(gè)位點(diǎn)降低了50%(圖4C)。值得注意的是，通過對磷酸化降低比例的比較，研究者發(fā)現(xiàn)三種磷酸化靶點(diǎn)，KIT Tyr721、P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK) Tyr182和血管內(nèi)皮生長因子受體2 (VEGFR2) Tyr951位點(diǎn)，它們的磷酸化通常被miR-181a mimic和PPFIA1-siRNA處理降低(圖4D)。

KIT與CML發(fā)病機(jī)制有關(guān)，KIT表達(dá)BCR- ABL轉(zhuǎn)導(dǎo)的小鼠髓系細(xì)胞對酪氨酸激酶抑制劑不太敏感。因此研究者推測miR-181a的靶點(diǎn)PPFIA1可能通過激活K562細(xì)胞的KIT信號通路促進(jìn)惡性表型。在穩(wěn)定過表達(dá)PPFIA1的K562細(xì)胞株中，磷酸化KIT Tyr721的表達(dá)顯著增加(圖4E)，而使用PPFIA1- siRNA抑制其表達(dá)則會產(chǎn)生相反的效果(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，PPFIA1可能通過激活CML中的KIT通路而發(fā)揮致癌作用。

圖4

5. PPFIA1和BCR/ABL的重要下游分子PARP1

為了探討PPFIA1和KIT之間的關(guān)系，研究者在K562細(xì)胞中異位過表達(dá)FLAG-PPFIA1，并進(jìn)行BCR/ FLAG免疫沉淀(IP)檢測。采用SDS-PAGE對BCR和FLAG親和純化的IP產(chǎn)物進(jìn)行分離，并進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示，在K562細(xì)胞中，PARP1同時(shí)與外源性PPFIA1和內(nèi)源性BCR相關(guān)(圖5A)。分子對接分析表明，PARP1催化結(jié)構(gòu)域可以與PPFIA1 (PDB: 3TAC)和ABL1 (PDB: 5HU9)結(jié)合(圖5B，C)。ABL1的結(jié)構(gòu)域取自PDB (F-actin PDB），分子對接分析結(jié)果顯示，ABL1的F-actin結(jié)構(gòu)域可以與PARP1的催化結(jié)構(gòu)域?qū)?圖5D)，而SH2結(jié)構(gòu)域不能與PARP1的催化結(jié)構(gòu)域?qū)?。由于無法獲得BCR/ABL融合蛋白，研究者純化了ABL的每個(gè)結(jié)構(gòu)域，并進(jìn)行了SPRi分析，結(jié)果證實(shí)ABL1的F-actin結(jié)構(gòu)域可以與PARP1結(jié)合，與分子對接分析結(jié)果一致(圖5E)。

有趣的是，除了分子對接分析表明PARP1可以與PPFIA1相互作用外，IP實(shí)驗(yàn)也可以識別這種相互作用。如圖5F-5I所示，PARP1與PPFIA1和ABL1相互作用，而且可能是PPFIA1或BCR/ABL的重要下游分子?；谶@些結(jié)果，研究者推測PARP1介導(dǎo)了PPFIA1和KIT過表達(dá)之間的關(guān)系。

圖5

6. PARP1通過激活NF-kB-P65轉(zhuǎn)錄促進(jìn)KIT表達(dá)

PARP1在參與DNA修復(fù)和轉(zhuǎn)錄的幾個(gè)蛋白上形成分支多聚(ADP)核糖(PAR)聚合物，其中，PARP1是NF-kB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的關(guān)鍵成分。因此，研究者推測PPFIA1通過涉及PARP1、P65和KIT的軸參與白血病的生長。與假設(shè)一致，在K562細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)PARP1導(dǎo)致P65表達(dá)水平上調(diào)，而使用奧拉帕尼(PARP1抑制劑[PARPi])降低PARP1表達(dá)則導(dǎo)致P65下調(diào)(圖6A-6C)。此外，在K562細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)P65導(dǎo)致KIT mRNA和蛋白上調(diào)，而P65- siRNA下調(diào)P65表達(dá)則導(dǎo)致KIT水平下調(diào)(圖6D-6F)。這些數(shù)據(jù)表明，PPFIA1通過與PARP1相互作用參與了KIT水平的調(diào)控，而PARP1調(diào)節(jié)NF-kB-P65的轉(zhuǎn)錄活性。PPFIA1/PARP1/NF-kB-P65/KIT可能在CML中構(gòu)成了一個(gè)調(diào)控軸。

接下來，為了探索靶向PARP1在CML中的治療潛力，研究者研究了奧拉帕尼對穩(wěn)定表達(dá)PPFIA1的K562細(xì)胞的影響。奧拉帕尼顯著抑制了表達(dá)PPFIA1的慢病毒轉(zhuǎn)化細(xì)胞的集落形成能力(圖6G)。為了驗(yàn)證奧拉帕尼可能抑制CML在體內(nèi)的進(jìn)展這一假設(shè)，研究者將Baf3-P210細(xì)胞移植到用3Gy X射線照射的BALB/c小鼠中。移植小鼠每天單獨(dú)服用奧拉帕利布或卒中生理鹽水溶液(賦形劑對照)，連續(xù)7天。接受奧拉帕利治療的動物比空載組的動物存活時(shí)間更長(圖6H)。這些結(jié)果表明，PARP是克服慢性粒細(xì)胞白血病的一種有前途的治療方法。

圖6