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客戶文章技術(shù)專題問題答疑
RIP/RIP-seq用于研究RNA修飾

RIPRIP-seq或RNA免疫沉淀、RNA免疫沉淀測序是一種高通量實驗技術(shù),用于研究RNA和RNA結(jié)合蛋白之間的相互作用。它允許識別細(xì)胞或組織內(nèi)的特定RNA結(jié)合蛋白。


為什么研究RNA修飾是有益的?

研究RNA修飾對于解開RNA生物學(xué)的復(fù)雜性,理解基因表達(dá)調(diào)控,破譯疾病機(jī)制以及探索診斷和治療應(yīng)用至關(guān)重要。它提供了對RNA分子及其在細(xì)胞過程和疾病中的作用的更深層次的理解。


RNA修飾的失調(diào)已經(jīng)涉及各種疾病,包括癌癥、神經(jīng)病癥和代謝病癥。了解RNA修飾為開發(fā)靶向治療方法提供了機(jī)會。通過操縱負(fù)責(zé)添加或刪除特定RNA修飾的酶,可以調(diào)節(jié)基因表達(dá),改變RNA結(jié)構(gòu)或糾正疾病狀態(tài)中的異常RNA修飾。此外,調(diào)節(jié)RNA修飾可以為治療干預(yù)提供新的途徑。了解RNA修飾及其功能后果的前景可以指導(dǎo)RNA靶向治療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)方法的發(fā)展。


RIP/RIP-seq提供了對RNA結(jié)合靶點(diǎn)的關(guān)鍵見解,以及RNA結(jié)合蛋白在RNA生物學(xué),基因表達(dá)調(diào)控和疾病中的機(jī)制作用。RIP-seq使研究人員能夠深入了解RNA靶點(diǎn)和RBP在各種細(xì)胞過程中的調(diào)控作用,如RNA剪接、穩(wěn)定性、運(yùn)輸和翻譯。通過比較來自不同實驗條件或細(xì)胞類型的RIP-seq數(shù)據(jù),研究人員可以研究RBP結(jié)合模式的變化,并揭示基因表達(dá)的潛在調(diào)控機(jī)制。它有助于我們理解RNA-蛋白質(zhì)相互作用,并且在揭示RBP在各種生物過程和疾病中的作用方面特別有價值。


RIP/RIP-seq是如何工作的?

RIP是一種涉及RBPs沿著其相關(guān)RNA分子的免疫沉淀的方法。該技術(shù)背后的原理是使用化學(xué)交聯(lián)劑(通常為甲醛)將RBP交聯(lián)到RNA,所述化學(xué)交聯(lián)劑在特定時刻“凍結(jié)”RNA和RBP之間的相互作用。然后使用對目標(biāo)RBP具有特異性的抗體對細(xì)胞或組織裂解物進(jìn)行免疫沉淀。然后純化免疫沉淀的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物,并逆轉(zhuǎn)交聯(lián)以釋放RNA分子。最后,分析富集的RNA以鑒定結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物。


RIP-seq將RIP技術(shù)與高通量測序技術(shù)相結(jié)合,允許對與RBP結(jié)合的RNA分子進(jìn)行全基因組鑒定和表征。在免疫沉淀步驟之后,將純化的RNA轉(zhuǎn)化為cDNA片段文庫,然后使用下一代測序平臺對其進(jìn)行測序。由此產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)提供了有關(guān)RBP結(jié)合的RNA序列的信息,使研究人員能夠識別目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本。


以下是RIP/RIP-seq工作流的概述:

1. 交聯(lián):RIP-seq的第一步涉及將RBP與細(xì)胞內(nèi)的RNA分子交聯(lián)。這通常通過用化學(xué)交聯(lián)劑如甲醛處理細(xì)胞來完成。交聯(lián)有助于保持RBP-RNA相互作用,并防止它們在隨后的加工步驟中解離。


2. 細(xì)胞裂解和免疫沉淀:然后裂解交聯(lián)的細(xì)胞以釋放細(xì)胞內(nèi)容物。將對靶RBP具有特異性的抗體添加到裂解物中,并且這些抗體選擇性地結(jié)合感興趣的RBP。然后使用蛋白A/G珠等技術(shù)免疫沉淀RBP-RNA復(fù)合物,其結(jié)合抗體-RBP復(fù)合物。


3. RNA片段化:用RNase處理免疫沉淀的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物以消化未結(jié)合的RNA分子,留下RBP結(jié)合的RNA。然后從復(fù)合物中除去RBP,只留下與感興趣的蛋白質(zhì)相關(guān)的RNA分子。


4. RNA純化:從剩余的蛋白質(zhì)片段、污染物和交聯(lián)中純化RNA。這一步驟涉及各種酶處理和柱純化,以獲得高質(zhì)量的RNA。


5. 文庫制備和測序:通過添加銜接子并擴(kuò)增RNA片段將純化的RNA轉(zhuǎn)化為測序文庫。然后使用下一代測序(NGS)技術(shù)等平臺對文庫進(jìn)行高通量測序。


6. 數(shù)據(jù)分析:將所得測序讀數(shù)與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組比對,以鑒定由RBP結(jié)合的RNA分子的區(qū)域。數(shù)據(jù)分析包括識別代表RBP結(jié)合位點(diǎn)的富集區(qū)域(峰),以及下游分析,以了解RBP-RNA相互作用的功能意義。



輝駿生物RIP(RNA免疫共沉淀)服務(wù)內(nèi)容


1. RIP-qPCR,用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測RNA是否結(jié)合;

2. RIP-seq,用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結(jié)合哪些RNA。


服務(wù)項目
服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實驗周期客戶提價格

RIP qPCR

(驗證型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)


點(diǎn)擊詢價


RIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

RIP實驗報告

誘餌蛋白Western blot檢測圖

待測RNA的qPCR檢測數(shù)據(jù)

RIP seq

(篩選型)

Western blot檢測樣本(input)中的誘餌蛋白Western blot檢測圖5-6周

實驗樣本

誘餌蛋白的IP級抗體

實驗信息表(樣本信息,誘餌蛋白序列)



點(diǎn)擊詢價


RIP調(diào)取誘餌蛋白及其結(jié)合的RNA

(2組:實驗組和對照組)

RIP實驗報告

誘餌蛋白Western blot檢測圖

seq檢測和分析

(2組:實驗組和input)

seq檢測結(jié)果

檢測和分析報告

9周



RNA免疫沉淀(RIP)* 實驗流程

RIP實驗,RNA結(jié)合蛋白免疫共沉淀,RIP-seq檢測實驗.jpg
圖一:內(nèi)源蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖

RIP-qPCR,rip技術(shù)實驗,rip實驗外包.jpg

圖二:標(biāo)簽融合蛋白的RNA免疫共沉淀流程圖



RIP實驗客戶文章


1. Bao X.C. et al: Capturing the interactome of newly transcribed RNA.Nature Methods,15(3): 213–220. 2018,IF=28.467.
【研究內(nèi)容】:輝駿生物為作者單位之一,和作者共同開發(fā)了一種捕獲鑒定新生RNA結(jié)合蛋白的全新方法(RICK)。該方法用EU標(biāo)記新生RNA,通過點(diǎn)擊反應(yīng)-生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)結(jié)合質(zhì)譜分析,分離鑒定RNA互作蛋白。其中,METTL1和CDK1是兩個RICK獨(dú)有的RNA結(jié)合蛋白。 RIP-qPCR、RIP-Seq、CLIP-Seq等實驗進(jìn)一步證實了它們與非PolyA RNA的結(jié)合,這種結(jié)合在細(xì)胞分化與增殖中發(fā)揮了重要作用。
使用相關(guān)技術(shù)RIP-qPCR、RNA免疫共沉淀RIP-Seq、RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀技術(shù)


2. Bao. X.C. et al: The p53-induced lincRNA-p21 derails somatic cell reprogramming by sustaining H3K9me3 and CpG methylation at pluripotency gene promoters. Cell Research.2015, IF=13.9.

【研究內(nèi)容】:客戶利用RNA pull down、CoIP等技術(shù),發(fā)現(xiàn)lincRNA-p21與HNRNPK結(jié)合,并和甲基化酶SETDB1、DNMT1形成復(fù)合物,作者通過RIP-qPCR進(jìn)一步證實了細(xì)胞中存在該復(fù)合物。該復(fù)合物甲基化了多能性基因的啟動子序列及相應(yīng)組蛋白,并改變了它們的表達(dá)量,從而進(jìn)一步影響體細(xì)胞重編程過程。

使用相關(guān)技術(shù)RIP seq、RNA結(jié)合蛋白疫共沉淀rip qpcr、質(zhì)譜鑒定


3. Zhang C Y . et al: CircVPRBP inhibits nodal metastasis of cervical cancer by impeding RACK1 O-GlcNAcylation and stability. Oncogene. 2023, IF=8.756.

【研究內(nèi)容】:淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌(CCa)患者最惡性的臨床特征之一。本研究利用RNA pull down、RIP和Co-IP等實驗發(fā)現(xiàn):circVPRBP與OGT酶競爭結(jié)合RACK1蛋白,阻礙RACK1-S122位點(diǎn)的O-GlcNAc修飾來使其降解,從而抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

使用相關(guān)技術(shù):RIP-qPCR、RNA pull down MS、免疫共沉淀Co-IP、質(zhì)譜鑒定



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