蛋白質(zhì)測(cè)序原理及步驟介紹

蛋白質(zhì)測(cè)序主要是依靠化學(xué)或酶消化的方法來(lái)分離多肽并檢測(cè)氨基酸殘基的數(shù)量和組成，這篇文章將介紹蛋白質(zhì)測(cè)序的原理和實(shí)驗(yàn)步驟。

目前，所謂的蛋白質(zhì)測(cè)序是指檢測(cè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其包含蛋白質(zhì)中多肽鏈的數(shù)量。多肽和蛋白質(zhì)可在許多情況下同等使用。多肽的氨基酸序列是蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。

聯(lián)系技術(shù)支持詳談蛋白測(cè)序?qū)嶒?yàn)

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測(cè)序步驟

1. 分裂多肽鏈

蛋白質(zhì)分子必須經(jīng)過(guò)分離純化。幾種多肽通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合在一起，稱為寡聚蛋白。比如用8 mol/L尿素或6 mol/ L鹽酸胍處理四聚體-血紅蛋白和二聚體-烯醇化酶。

2. 蛋白質(zhì)分子中多肽數(shù)目的檢測(cè)

多肽的數(shù)目可通過(guò)檢測(cè)氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質(zhì)分子量之間的關(guān)系來(lái)確定。

3. 斷裂二硫鍵

幾條多肽鏈通過(guò)二硫鍵連接。在8 mol/ L尿素或6 mol/ L鹽酸胍條件下，過(guò)量的[β]巰基乙醇將二硫鍵還原為硫醇。然后用烷基試劑保護(hù)，防止再氧化。

裂解和保護(hù)二硫鍵
A. 過(guò)甲酸：-CH2SO3H
B. 還原+氧化：巰基乙醇，DTT +碘乙酸，-S-CH 2-COOH
C. 亞硫酸分解：-R1-S-S-R2 + HSO3-，R1-S- + R2-S-SOH3

4. 檢測(cè)多肽鏈的氨基酸組成并計(jì)算氨基酸組成的分子比

5. 多肽鏈的N-末端和C-末端測(cè)序

多肽的氨基酸分為兩類：氨基末端和羧基末端。在肽鏈氨基酸序列分析中，N端比C端更為重要。

6. 多肽可以被切割成幾個(gè)小肽?？梢允褂脙煞N以上的方法將肽樣品斷裂成兩組或更多組肽或肽片段，然后將它們分離。

7. 確定每種肽的氨基酸測(cè)序

8. 測(cè)定多肽鏈中肽段的序列

9. 確定原始多肽鏈中二硫鍵的位置

通常，胃蛋白酶將用于處理具有二硫鍵的那些多肽鏈。然后用二維電泳技術(shù)分離每個(gè)肽段。分析可能含有二硫鍵的肽段的組成和序列。然后將其與其它方法分析的肽片段進(jìn)行比較，確定二硫鍵的位置。

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