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中文標(biāo)題：Lnc-GD2H促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化的機(jī)制研究

發(fā)表期刊：Frontiers in Cell and Developmental Biology

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：6.684

發(fā)表時(shí)間：2021年8月

合作單位：廣東省第二中醫(yī)院

運(yùn)用技術(shù)：ChIP qPCR、RIP-qPCR、RNA  pull down MS、DNA pull down、雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

成肌細(xì)胞決定蛋白（MyoD）、肌源性因子5（Myf5）、肌生成素（Myog）和肌特異性調(diào)節(jié)因子4（MRF4）等肌源性調(diào)節(jié)因子（MRFs）主要調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖、分化和融合。除此之外，非肌肉特異性轉(zhuǎn)錄因子也參與肌肉再生，例如NACA可以與Myog啟動(dòng)子結(jié)合，抑制Myog轉(zhuǎn)錄和成肌細(xì)胞分化；c-Myc可以通過(guò)miRNA和長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）的轉(zhuǎn)錄來(lái)調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的增殖和分化。研究團(tuán)隊(duì)之前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一種lncRNA Gm13398在小鼠C2C12成肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中高表達(dá)，并在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中與Myog共表達(dá)。本研究將Gm13398命名為lnc-GD2H，探討了其在成肌細(xì)胞的增殖和分化中的作用。

● 研究結(jié)果

1. Lnc-GD2H在成肌細(xì)胞增殖和分化中的表達(dá)模式及RNA-FISH定位

qPCR檢測(cè)了lnc-GD2H、c-Myc和Myog在C2C12成肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中的表達(dá)模式。圖1A為成肌細(xì)胞形態(tài)，lnc-GD2H的水平隨增殖和分化過(guò)程而逐漸增加（圖1B）。c-Myc在增殖過(guò)程中上調(diào)，但在分化后下調(diào)（圖1C）。Myog在分化過(guò)程中顯著上調(diào)（圖1D）。這些結(jié)果表明lnc-GD2H可能是一種參與細(xì)胞增殖和分化的肌源性因子。RNA FISH顯示，在成肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，lnc-GD2H分布在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核（圖1E）。

  圖1

2. Lnc-GD2H促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)該過(guò)程中的c-Myc表達(dá)                                                              

接著，研究人員構(gòu)建了lnc-GD2H過(guò)表達(dá)的C2C12成肌細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株（圖2A），并通過(guò)不同實(shí)驗(yàn)確定了lnc-GD2H在成肌細(xì)胞增殖中的潛在功能。qPCR和WB結(jié)果表明lnc-GD2H過(guò)表達(dá)導(dǎo)致c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6這些增殖標(biāo)志物的mRNA和蛋白水平升高（圖2B、C）。lnc-GD2H過(guò)表達(dá)細(xì)胞中的EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比顯著高于對(duì)照（圖2D，E）。CCK-8和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)lnc-GD2H過(guò)表達(dá)使成肌細(xì)胞有更高的存活率，促進(jìn)了其增殖和遷移潛力。相反，lnc-GD2H干擾（圖3A）抑制了C2C12細(xì)胞的增殖，c-Myc、CDK2、CDK4和CDK6 mRNA（圖3B）和蛋白質(zhì)（圖3C）水平降低，EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比降低（圖3D，E），細(xì)胞存活率降低（圖3F）。細(xì)胞劃痕12和24小時(shí)，lnc-GD2H干擾細(xì)胞中的傷口大小顯著大于對(duì)照細(xì)胞（圖3G，h）。這些結(jié)果表明，lnc-GD2H對(duì)C2C12成肌細(xì)胞增殖有至關(guān)重要，并可能促進(jìn)c-Myc的表達(dá)。

圖2

圖3

3. c-Myc在成肌細(xì)胞增殖過(guò)程中調(diào)節(jié)Lnc-GD2H的轉(zhuǎn)錄

那么，轉(zhuǎn)錄因子c-Myc是否也會(huì)影響Lnc-GD2H水平呢？研究人員同時(shí)構(gòu)建了c-Myc過(guò)表達(dá)和干擾的C2C12穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株（圖4A-B，D-E），c-Myc過(guò)表達(dá)或干擾分別促進(jìn)和抑制了lnc-GD2H的水平（圖4C-F）。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)c-Myc增強(qiáng)了lnc-GD2H啟動(dòng)子的活性（圖4G，H）；DNA pull down WB實(shí)驗(yàn)再次確定了lnc-GD2H啟動(dòng)子和c-Myc蛋白的結(jié)合（圖4I）。之后，截短啟動(dòng)子的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)結(jié)合位點(diǎn)存在于lnc-GD2H啟動(dòng)子中?1400至?2000的位置（圖4J），研究者預(yù)測(cè)了c-Myc轉(zhuǎn)錄因子的三個(gè)結(jié)合位點(diǎn)（圖4K）并同時(shí)突變它們，發(fā)現(xiàn)c-Myc不再促進(jìn)lnc-GD2H啟動(dòng)子的活性（圖4L），表明c-Myc可以與lnc-GD2H啟動(dòng)子上的這些位點(diǎn)結(jié)合。

圖4

4. Lnc-GD2H在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中促進(jìn)細(xì)胞分化

C2C12分化過(guò)程中的lnc-GD2H表達(dá)增加，提示lnc-GD2H也可能在成肌細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：lnc-GD2H過(guò)表達(dá)后，MyHC蛋白（一種終末分化標(biāo)志物）的免疫熒光增強(qiáng)（圖5A），MyHC蛋白WB條帶也顯著高于對(duì)照（圖5C），成肌細(xì)胞的融合指數(shù)更高（圖5B），肌源性標(biāo)志物基因Myog、Mef2a和Mef2c的表達(dá)增加（圖5D，E），這些結(jié)果表明了C2C12分化的顯著加速。相反，lnc-GD2H干擾抑制了C2C12成肌細(xì)胞分化，表現(xiàn)為：MyHC免疫染色和蛋白水平降低（圖5F，H），融合指數(shù)降低（圖5G），Myog、Mef2a和Mef2c的表達(dá)減弱（圖5I，J）。

圖5

5. Lnc-GD2H與NACA蛋白相互作用

為了研究lnc-GD2H的相互作用蛋白，他們采用生物素RNA pull down MS實(shí)驗(yàn)，調(diào)取并鑒定了lnc-GD2H的互作蛋白（圖6A），驚喜的發(fā)現(xiàn)了參與細(xì)胞發(fā)育過(guò)程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子NACA（圖6B，C）。在線(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)RPISeq的分析結(jié)果也表明lnc-GD2H很可能與NACA結(jié)合（圖6D）。為了驗(yàn)證它們之間的相互作用，研究人員用C2C12細(xì)胞提取物進(jìn)行了RIP qPCR檢測(cè)（圖6E，F(xiàn)），結(jié)果顯示，與IgG對(duì)照相比，NACA抗體的pull down富集了更多的lnc-GD2H（圖6F），證實(shí)了lnc-GD2H與NACA蛋白的相互作用。

圖6

6. Lnc-GD2H降低了Myog啟動(dòng)子中的NACA蛋白富集

基于以前的報(bào)道，研究者預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)Myog基因的啟動(dòng)子區(qū)域存在NACA蛋白的兩個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)，因此他們做了野生和突變Myog啟動(dòng)子的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示NACA顯著降低了野生Myog啟動(dòng)子的活性（圖7A），但不能降低突變Myog啟動(dòng)子的活性（圖7B），表明這兩個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)可能是NACA的結(jié)合位點(diǎn)。此外，NACA干擾增強(qiáng)了Myog的mRNA（圖7C）和蛋白質(zhì)水平（圖7D）。lnc-GD2H的過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)了NACA過(guò)表達(dá)引起的Myog啟動(dòng)子雙熒光素酶活性下降（圖7E）。此外，ChIP-PCR顯示，lnc-GD2H過(guò)表達(dá)顯著干擾了NACA在Myog啟動(dòng)子區(qū)的富集（圖7F）。這些發(fā)現(xiàn)表明lnc-GD2H可以與轉(zhuǎn)錄因子NACA結(jié)合來(lái)減輕NACA對(duì)Myog的抑制作用，改善Myog的轉(zhuǎn)錄以促進(jìn)成肌細(xì)胞分化。

圖7

7. Lnc-GD2H促進(jìn)肌肉的損傷修復(fù)和再生

以上研究結(jié)果強(qiáng)調(diào)了lnc-GD2H在成肌細(xì)胞增殖和分化中的作用，提示lnc-GD2H可能對(duì)肌肉再生有影響。接下來(lái)，研究者給小鼠注射CTX來(lái)誘導(dǎo)損傷，并在注射CTX的前一天（-1）、注射后的第1天和第4天分別注射三次silnc-GD2H和siNC（圖8A），來(lái)觀(guān)察lnc-GD2H對(duì)體內(nèi)肌肉再生的影響。H&E染色顯示，在CTX損傷后的第3天和第6天， silnc-GD2H注射肌肉的再生肌纖維明顯小于siNC注射肌肉（圖8B），并且在損傷第6天的平均CSA也較?。▓D8C）。在損傷第3天，注射silnc-GD2H導(dǎo)致lnc-GD2H顯著下調(diào)（圖8D），c-Myc和Myog的mRNA（圖8D）和蛋白質(zhì)（圖8E）水平也顯著降低。損傷第6天也有類(lèi)似的結(jié)果（圖8F、G），這些結(jié)果表明lnc-GD2H可能促進(jìn)肌肉損傷的修復(fù)和肌肉再生。

圖8

● 研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)lnc-GD2H對(duì)C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化有顯著貢獻(xiàn)。lnc-GD2H通過(guò)與c-Myc形成反饋環(huán)來(lái)促進(jìn)增殖，并通過(guò)與NACA相互作用來(lái)上調(diào)Myog從而增強(qiáng)分化。這些結(jié)果為lncRNA參與肌肉再生的調(diào)控提供了新的思路和治療靶點(diǎn)。

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