中文標(biāo)題：LncRNA FOXD3-AS1通過募集H3K27Ac促進(jìn) YBX1轉(zhuǎn)錄和鼻咽癌發(fā)展

發(fā)表期刊：Frontiers in Oncology

影響因子：4.7

發(fā)表時間：2021年7月

合作單位：中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院腫瘤科

運(yùn)用技術(shù)：RNA pull down MS、RNA免疫沉淀（RIP）、LC-MS/MS質(zhì)譜檢測（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

長鏈非編碼RNA（lncRNA）可影響各種腫瘤的進(jìn)展，包括鼻咽癌（NPC）。已有報(bào)道lncRNA FOXD3-AS1影響多種癌癥的進(jìn)展，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在NPC組織中高度表達(dá)，并與NPC的惡性進(jìn)展有關(guān)，但FOXD3-AS1影響NPC惡性進(jìn)展的機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。

● 研究結(jié)果

1、LncRNA FOXD3-AS1在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中過表達(dá)

首先，研究者通過GSE數(shù)據(jù)集查找發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3-AS1在NPC組織中的表達(dá)水平顯著高于正常鼻咽組織（圖1A、B）。其次，TCGA公共數(shù)據(jù)庫也顯示FOXD3-AS1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和NPC組織中都有高表達(dá)（圖1C、D）。RT-qPCR檢測六種鼻咽癌細(xì)胞系（HNE1、HK1、HONE1、CNE1、CNE2和SUNE1，圖1E）和正常鼻咽上皮細(xì)胞系（NP69，圖1E），也發(fā)現(xiàn)FOXD3-AS1在NPC細(xì)胞系中表達(dá)顯著上調(diào)（圖1E）。LNCipedia數(shù)據(jù)庫分析（圖1F）和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖1G）證實(shí)FOXD3-AS1沒有編碼蛋白質(zhì)的能力。

圖1

2、LncRNA FOXD3-AS1體外促進(jìn)鼻咽癌惡性進(jìn)展

為了闡明FOXD3-AS1在NPC細(xì)胞系中的作用，在SUNE1和HONE1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染sh RNA質(zhì)粒（shF1和shF2）敲低FOXD3-AS1的表達(dá)（圖2A）。CCK-8測定和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FOXD3-AS1敲低導(dǎo)致NPC細(xì)胞增殖減少（圖2B、C），Transwell結(jié)果顯示敲低FOXD3-AS1導(dǎo)致NPC細(xì)胞遷移能力（圖2D）和侵襲能力減弱（表2E）。

圖2

3、LncRNA FOXD3-AS1特異性靶向YBX1并調(diào)控YBX1的表達(dá)

通過核質(zhì)分離和FISH實(shí)驗(yàn)確定了FOXD3-AS1同時存在于NPC細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，但在細(xì)胞核里面的含量更高（圖3A、B）。為了找到FOXD3-AS1的靶蛋白，研究者進(jìn)行了RNA pull-down（圖3C）和質(zhì)譜(MS)分析鑒定（圖3D），鑒定到潛在結(jié)合蛋白YBX1，RNA pulldown WB技術(shù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了FOXD3-AS1可以與YBX1結(jié)合（圖E）。RNA免疫沉淀（RIP）qPCR實(shí)驗(yàn)操作再次確認(rèn)了YBX1是FOXD3-AS1的靶蛋白（圖F）。為了探討FOXD3-AS1和YBX1的表達(dá)關(guān)系，在體外NPC細(xì)胞系中敲低FOXD3-AS1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)YBX1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平受到抑制（圖3G，H）。當(dāng)FOXD3-AS1過表達(dá)時，YBX1的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平也跟著上調(diào)（圖3I，J）。

圖3

4、LncRNA FOXD3-AS1通過募集H3K27ac調(diào)節(jié)YBX1的表達(dá)

為什么lncRNA FOXD3-AS1能調(diào)控YBX1的表達(dá)呢？生信分析發(fā)現(xiàn)YBX1的啟動子可以結(jié)合H3K27ac（圖4A）。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，研究者進(jìn)行了H3K27ac的染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）分析，YBX1啟動子區(qū)qPCR產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1敲低顯著降低了YBX1啟動子區(qū)的H3K27ac富集（圖4B）。野生型和突變型YBX1的雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，敲低FOXD3-AS1抑制了H3K27ac在YBX1啟動子區(qū)的富集（圖4D）。使用組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶的抑制劑C646阻斷H3K27的乙?；?，發(fā)現(xiàn)YBX1的表達(dá)降低，表明H3K27ac會影響YBX1的表達(dá)（圖4C）。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FOXD3-AS1可以通過募集H3K27ac來調(diào)節(jié)YBX1的表達(dá)。

圖4

5、YBX1可逆轉(zhuǎn)lncRNA FOXD3-AS1敲低誘導(dǎo)的增殖、遷移和侵襲

為了研究FOXD3-AS1是否通過靶向YBX1促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，在敲低FOXD3-AS的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染YBX1過表達(dá)質(zhì)粒（圖5A），經(jīng)CCK8檢測（圖5B），克隆形成實(shí)驗(yàn)（圖5C）和Transwell實(shí)驗(yàn)（圖5D、E）發(fā)現(xiàn)，YBX1可以逆轉(zhuǎn)FOXD3-AS1敲低對腫瘤的抑制作用。

圖5

6、LncRNA FOXD3-AS1在體內(nèi)促進(jìn)NPC惡性進(jìn)展

為了證實(shí)lncRNA FOXD3-AS1在NPC惡性進(jìn)展中的作用，研究者將FOXD3-AS1敲低的NPC細(xì)胞和對照細(xì)胞注射到小鼠體內(nèi)構(gòu)建了腫瘤生長轉(zhuǎn)移模型，結(jié)果顯示FOXD3-AS1敲低組的移植瘤較?。▓D6A、B），重量較輕（圖6C）且肺轉(zhuǎn)移較少（圖6D-F）。原位雜交結(jié)果顯示FOXD3-AS1敲低組腫瘤組織中的FOXD3-AS1表達(dá)降低了（圖6G，左）。免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3-AS1敲低組腫瘤組織中的YBX1表達(dá)也降低了（圖6G,右）。

圖6

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