單細(xì)胞基因組測序確定了在帕金森病中退化的人類多巴胺神經(jīng)元亞群

發(fā)布時(shí)間：2022-05-11 09:27:07作者：輝駿生物-fitgene

最近研究人員開發(fā)了一種新的協(xié)議，使用單細(xì)胞基因組測序檢查從帕金森病 (PD) 患者中提取的多巴胺 (DA) 神經(jīng)元。該項(xiàng)研究已成功發(fā)表在《Nature Neuroscience》雜志上。

背景

研究尚未完全闡明黑質(zhì)致密部 (SNpc) 內(nèi)退化的 DA 神經(jīng)元的分子特征，這是 PD 和路易體癡呆 (LBD) 的病理標(biāo)志。此外，研究人員幾乎沒有評估導(dǎo)致 PD 中 DA 丟失的分子事件級聯(lián)，了解這些事件對于改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室 PD 模型和幫助開發(fā)疾病特異性療法至關(guān)重要。

單細(xì)胞核糖核酸測序 (scRNA-seq) 技術(shù)能夠以單細(xì)胞分辨率對人類 SNpc 進(jìn)行分析和可視化。然而，采樣的 DA 神經(jīng)元的樣本量仍然相對較小，這使得識別細(xì)胞類型特異性變化具有挑戰(zhàn)性。

關(guān)于研究

在本研究中，研究人員開發(fā)了一種新的基于熒光激活核分選 (FANS) 的協(xié)議，用于從死后的人類 SNpc 中選擇性富集 DA 神經(jīng)元核，用于單核 RNA 測序 (snRNA-seq)。使用這項(xiàng)先進(jìn)技術(shù)，他們確定了十個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的 DA 神經(jīng)元群。

接下來，研究人員使用另一種高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù) slide-seq 沿 SNpc 背腹軸對十個(gè)不同的 DA 神經(jīng)元群進(jìn)行空間定位。此外，他們分別對每個(gè)供體物種進(jìn)行了聚類分析，以將配置文件分配給七個(gè)主要細(xì)胞類別之一，包括 DA 神經(jīng)元。他們使用了來自大鼠、小鼠和獼猴的快速冷凍腦組織樣本，包括食蟹猴、Tupaia belangeri、Rattus norvegicus 和 Mus musculus。

研究人員將人類中腦和尾狀核顯微解剖成 5 個(gè)和 10 個(gè) 60 μm 切片。然后，對冷凍保存在-15至-20°C的切片進(jìn)行免疫標(biāo)記。為了檢索 2.5-4.0% 的高熒光多巴胺能核受體亞家族 4 A 組成員 2 (NR4A2) 細(xì)胞核，該團(tuán)隊(duì)使用基于 FANS 的協(xié)議使用流式分選機(jī)。同樣，他們對 NR4A2 陰性或 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 染色的細(xì)胞核進(jìn)行了 snRNA-seq。

研究結(jié)果

本研究對人類 SNpc DA 神經(jīng)元產(chǎn)生了顯著的分子分類。研究人員生成了 184,673 個(gè)一流的配置文件，每個(gè)供體的平均唯一分子標(biāo)識符 (UMI) 為 8810 個(gè)，每個(gè)個(gè)體的基因中位數(shù)為 3,590 個(gè)。每個(gè)細(xì)胞的 UMI 中位數(shù)為 8,086，每個(gè)細(xì)胞的基因中位數(shù)為 3,462，其中 43.6% 來自通過流式細(xì)胞術(shù)觀察到的 NR4A2 陽性細(xì)胞。

作者觀察到 NR4A2 分選的核譜中 70 倍的 DA 神經(jīng)元富集，共同表達(dá)酪氨酸羥化酶 (TH)、溶質(zhì)載體家族 6 成員 3 (SLC6A3) 和溶質(zhì)載體家族 18 成員 2 (SLC18A2) 基因。值得注意的是，由這些基因簇編碼的轉(zhuǎn)錄因子 (TF) 對于 DA 神經(jīng)傳遞至關(guān)重要。

此外，作者觀察到 DA 亞群 SRY-box 轉(zhuǎn)錄因子 6 (SOX6)-血管緊張素 II I 型受體 (AGTR1) 在與 PD 相關(guān)的基因中高度富集。先前的全基因組關(guān)聯(lián) (GWA) 研究也進(jìn)行了類似的觀察，表明 PD 相關(guān)的遺傳風(fēng)險(xiǎn)優(yōu)先影響最脆弱神經(jīng)元的存活。檢查遲發(fā)性常染色體顯性遺傳 (AD) 遺傳風(fēng)險(xiǎn)的研究也得出了類似的觀察結(jié)果。

SOX_AGTR1 細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄變化涉及由腫瘤蛋白 p53 (TP53) 和核受體亞家族 2 組 F 成員 2 (NR2F2) 基因編碼的 TF 調(diào)節(jié)的幾種細(xì)胞應(yīng)激途徑。這些途徑，例如，由 NR2F2 編碼的 TF，促進(jìn) PD 中的線粒體功能障礙。因此，這些似乎對 PD 相關(guān)的神經(jīng)元死亡至關(guān)重要。

有趣的是，snRNA-seq 數(shù)據(jù)表明，只有一組 DA 亞群（共 10 個(gè)），calbindin 1 (CALB1)_GEM，是獼猴和人類獨(dú)有的，而在小鼠和大鼠中則不存在。他們在 SNpc 的背層中發(fā)現(xiàn)了 CALB1_GEM 細(xì)胞，該細(xì)胞在靈長類動(dòng)物而非嚙齒動(dòng)物中擴(kuò)增得更多。因此，使用非人類靈長類動(dòng)物 (NHP) 模型的研究應(yīng)該驗(yàn)證獨(dú)特的 CALB1_GEM 群體是否負(fù)責(zé)建立從靈長類動(dòng)物背層神經(jīng)元直接到皮層的非典型投射。

結(jié)論

研究結(jié)果表明，細(xì)胞特異性分子機(jī)制在某些 DA 神經(jīng)元群體對 PD 變性的選擇性脆弱性中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)有助于指導(dǎo) PD 相關(guān)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，評估 PD 相關(guān)信號對特定人類 DA 亞型的定位。

進(jìn)一步完善體外 DA 神經(jīng)元分化方案和 DA 亞型定義可以幫助對神經(jīng)元易損性進(jìn)行基因篩查和測試治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病（如 PD）的藥物。

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