研究人員在置換的內(nèi)含子-外顯子 (PIE) 系統(tǒng)中制造了人造環(huán)狀核糖核酸 (circRNA) 海綿，并表明這些海綿不會(huì)激活先天免疫。

研究背景

天然存在的circRNA是自然界中豐富的一類非編碼RNA，但其分子功能尚不清楚。  當(dāng)作為 microRNA (miRNA) 海綿發(fā)揮作用時(shí)，circRNA 調(diào)節(jié)和中和內(nèi)源性 miRNA 水平。  因此，研究者近年來(lái)對(duì) circRNA 的研究對(duì)于醫(yī)學(xué)和藥物科學(xué)的發(fā)展變得越來(lái)越重要。

在他們之前的一項(xiàng)工作中，作者開發(fā)了一種 體外 生產(chǎn)和純化人工 circRNA 海綿 (ciRS) 作為 miRNA 抑制新劑的方法。 使用丙型肝炎病毒 (HCV) 模型，他們證明人工 ciRS 能夠隔離成熟的 miRNA 以削弱其生物學(xué)功能。 隨后，他們證明了 ciRS 可以靶向 miR-21，這是最早發(fā)現(xiàn)的致癌 miRNA 之一。 對(duì)小動(dòng)物的研究表明，人工 ciRS 如何隔離 miR-21 以抑制腫瘤生長(zhǎng)。

總體而言，ciRS 已成為一種新的藥物，可抑制多種人類疾病中的 miRNA 活性，包括癌癥和病毒感染。

甚至基于信使 mRNA 的 2019 年冠狀病毒病 (COVID-19) 疫苗也使用 體外 轉(zhuǎn)錄的 RNA。 因此，研究治療性 circRNA 在全身遞送時(shí)是否會(huì)觸發(fā)宿主細(xì)胞中的抗病毒反應(yīng)將是有趣的。 值得注意的是，基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗繞過(guò)了細(xì)胞免疫，從而獲得了臨床應(yīng)用的成功。

關(guān)于研究

在本研究中，研究人員用線性和環(huán)狀 miR-21 (liRS/ciRS-21-bu) 和對(duì)照 RNA (liRS/ciRS-21-rnd) 轉(zhuǎn)染 A549 細(xì)胞，然后通過(guò) RNA 測(cè)序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析以鑒定免疫轉(zhuǎn)染后激活的信號(hào)通路。

為了提高 體外 生產(chǎn)的 circRNA 的純度，他們使用了聚丙烯酰胺凝膠純化方法。 在純化過(guò)程中特定的聚丙烯酰胺濃度下，circRNA 在空間上與其他分子種類分離。 他們還進(jìn)行了差異基因表達(dá)分析 (DGEA) 以鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中差異表達(dá)的 mRNA。

該團(tuán)隊(duì)還創(chuàng)建了一個(gè)廣泛的雙鏈 circRNA (ciRS-21-ds)，其基本結(jié)構(gòu)與 ciRS-21-bu 和 ciRS-21-rnd 相同，但包含 50 個(gè)堿基對(duì) (bp) 的隨機(jī)自互補(bǔ)序列。  最后，研究人員使用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-qPCR) 評(píng)估了轉(zhuǎn)染細(xì)胞中通過(guò) RNA 測(cè)序鑒定的上調(diào)基因的 mRNA 水平。

研究結(jié)果

基因本體（GO）富集分析揭示了用 ciRS-21-bu 處理后幾個(gè)基因的上調(diào)。   其中，6個(gè)基因與先天免疫反應(yīng)相關(guān)，包括趨化因子配體（CXCL）1、2、3和8，以及早期生長(zhǎng)反應(yīng)1（EGR1）、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶2（IRAK2）、和腫瘤壞死因子受體 (TNFR) 相關(guān)因子 1 (TRAF1)。

令人驚訝的是，ciRS-21-ds 還上調(diào)了蛋白激酶 R (PKR)，這是細(xì)胞免疫中的關(guān)鍵 RNA 傳感器，因此表明序列組成和廣泛的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件可能在抗病毒防御的誘導(dǎo)中發(fā)揮作用。  此外，DGEA 數(shù)據(jù)顯示轉(zhuǎn)染 ciRS/liRS-21-bu 或 ciRS/liRS-21-rnd 的細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組非常相似。

ciRS-21-ds 在序列內(nèi)顯示出高度可信的堿基配對(duì)相互作用，最大長(zhǎng)度為 50 bps，從而形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。 然而， 體外生產(chǎn)效率較低并對(duì)轉(zhuǎn)錄效率產(chǎn)生不利影響，并改變了聚丙烯酰胺-尿素凝膠內(nèi)的流動(dòng)性。

正如在 RT-qPCR 中觀察到的，少量 ciRS-21-ds 足以增加與先天免疫信號(hào)相關(guān)的 mRNA 水平。  然而，轉(zhuǎn)染 ciRS-21-bu 的 A549 細(xì)胞需要更高劑量的 circRNA 才能將這些 mRNA 的上調(diào)降至最低。

結(jié)論

在本研究中，研究人員分析了用 體外 生產(chǎn)和聚丙烯酰胺-尿素凝膠純化的人工 circRNA 海綿處理的 A549 細(xì)胞的先天免疫反應(yīng)。 有趣的是，這些 circRNA 并沒(méi)有觸發(fā)細(xì)胞先天免疫。

該研究還表明，與未修飾的 RNA 相比，核苷異構(gòu)體和 RNA 修飾可抑制先天免疫。  值得注意的是，這種方法已被用于在基于 mRNA 的 COVID-19 疫苗中從先天免疫系統(tǒng)中掩蓋 RNA 治療劑。

總而言之，人工 circRNA 或 ciRS 治療劑可以提供免疫調(diào)節(jié)作用。  因此，它可以在特別需要繞過(guò)先天免疫系統(tǒng)的產(chǎn)品中找到潛在的應(yīng)用。

蛋白組/代謝組實(shí)驗(yàn)

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

? miRNA靶基因驗(yàn)證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫(kù)

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測(cè)序

? 抗體從頭測(cè)序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒

輝駿實(shí)力