国内嫖妓在线视频,亚洲无码视屏,国产aⅴ一区二区,久久vs视频欧美色图国产vS视频欧美vS色图 ,韩国AV在线免费观看,欧美涩涩网

DNA 復(fù)制反應(yīng)是細(xì)胞增殖的核心，與癌癥、衰老和發(fā)育障礙等人類疾病的病因?qū)W密切相關(guān)。 復(fù)制叉是正在進(jìn)行的 DNA 合成的場所，它既是一個擁擠又充滿活力的地方，在正常復(fù)制條件下或特別是在復(fù)制應(yīng)激線索之后，各種蛋白質(zhì)在全球或特定基因組區(qū)域不斷或短暫地結(jié)合在一起。 除了眾所周知的復(fù)制體成分外，最近還發(fā)現(xiàn)了各種以其在 DNA 修復(fù)或其他細(xì)胞過程中的功能而聞名的因素與復(fù)制叉有關(guān)。 這些相互作用的動態(tài)可以提供有關(guān)在特定環(huán)境中復(fù)制叉或復(fù)制位點附近發(fā)生的問題或反應(yīng)類型的有價值的信息。 因此，能夠提供有關(guān)復(fù)制過程和相關(guān)蛋白質(zhì)的敏感和定量信息的工具對于我們對復(fù)制相關(guān) DNA 代謝的理解至關(guān)重要。 追求這一追求，出現(xiàn)了允許全基因組監(jiān)測復(fù)制過程的革命性方法。

特別值得一提的是分子梳理，這是一種單分子分辨率分析，涉及基因組梳理和復(fù)制叉速度和源間距離的監(jiān)測。染色質(zhì)免疫沉淀（IP；ChIP）-on-chip/ChIP 測序（ChIP-seq）結(jié)合芯片上的 BrdU-IP，測量蛋白質(zhì)-DNA 相互作用水平與正在進(jìn)行的區(qū)域的技術(shù)通過使用細(xì)胞群實驗以全基因組方式摻入胸苷類似物 BrdU 揭示了復(fù)制。 這些技術(shù)繼續(xù)證明對于理解復(fù)制過程和受蛋白質(zhì)與染色質(zhì)動態(tài)結(jié)合影響的其他染色體結(jié)構(gòu)過程非常有用。 但是，由于它們很費力，因此不適合大屏幕。

與 ChIP-on-chip/ChIP-seq 方法相關(guān)，但專注于發(fā)現(xiàn)與新生 DNA 相關(guān)的蛋白質(zhì)，而不是在染色質(zhì)上精確定位它們的位置，是使用在新生 DNA 上分離蛋白質(zhì) (iPOND)，這是一項突破性的技術(shù)，其中與新復(fù)制的 DNA 交聯(lián)的蛋白質(zhì)被分離和解析。 在 iPOND 中，新復(fù)制的 DNA 用胸苷類似物 EdU 標(biāo)記，并使用點擊化學(xué)與生物素結(jié)合。 在染色質(zhì)剪切和基因組純化后，通過蛋白質(zhì)印跡分析或通過使用質(zhì)譜法在細(xì)胞培養(yǎng)中用氨基酸 (SILAC) 進(jìn)行穩(wěn)定同位素標(biāo)記來解析與生物素化 DNA 交聯(lián)的蛋白質(zhì)。 ChIP-on-chip 和 iPOND 都非常有價值，但它們很費力，需要大量的起始材料，并且定量潛力有限。 更進(jìn)化的 ChIP-seq 和 iPOND-SILAC 技術(shù)是定量的，但它們需要高成本和專用設(shè)備。 在這個問題上， 實驗人員描述了一種靈敏而準(zhǔn)確的單細(xì)胞分辨率技術(shù)，可以輕松識別與新復(fù)制 DNA 結(jié)合的蛋白質(zhì)。

這項新技術(shù)被稱為 DNA 復(fù)制叉處蛋白質(zhì)相互作用的原位分析 (SIRF)，是 iPOND 和鄰近連接分析 (PLA) 的改進(jìn)版本，用于檢測和測量原位蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用。 在 SIRF 中，就像在 iPOND 中一樣，新合成的 DNA 用 EdU 標(biāo)記，然后通過 EdU 和生物素-疊氮化物之間的點擊化學(xué)進(jìn)行生物素化。 在 SIRF 中，細(xì)胞隨后與針對生物素和目標(biāo)蛋白質(zhì)的一抗一起孵育（ 圖 1 ），然后該協(xié)議遵循改進(jìn)的、高度靈敏和準(zhǔn)確的 PLA 檢測的原則。 也就是說，將細(xì)胞與偶聯(lián)有作為鄰近探針的寡核苷酸的二抗一起孵育。 如果二抗接近 <40 nm，表明檢測的蛋白質(zhì)和生物素化 DNA 之間存在直接相互作用，則 DNA 寡聚體能夠退火，引導(dǎo)形成有切口的環(huán)狀 DNA 分子。 連接后，DNA 環(huán)作為模板用于局部滾環(huán)擴(kuò)增。 然后將 DNA 序列特異性熒光 DNA 探針與擴(kuò)增的 DNA 環(huán)退火，從而使信號可視化和量化（ 圖1 ）。

圖一：SIRF 工作流程

(A) 新生 DNA 用 EdU 標(biāo)記。 (B) 新生 DNA 使用點擊化學(xué)進(jìn)行生物素化。 (C) 使用針對因子 X 和生物素化 DNA 的一抗進(jìn)行原位雜交。 一抗被與序列特異性 DNA 寡聚體偶聯(lián)的二抗識別。 如果因子 X 和新生 DNA 接近，寡聚物會退火并形成環(huán)狀 DNA 分子，然后將其連接起來。 (D) 滾動循環(huán)復(fù)制為每個表位與表位的相互作用產(chǎn)生了大約 100 個環(huán)狀 DNA 分子。 環(huán)狀 DNA 分子隨后被熒光探針識別，從而為產(chǎn)生的相互作用信號提供放大和特異性。

在他們的研究中，實驗人員提供了 SIRF 中靈敏度、接近度和定量的驗證數(shù)據(jù)。 作者通過幾個已知或預(yù)期與復(fù)制叉相關(guān)的蛋白質(zhì)示例順利地引導(dǎo) SIRF 讀者，例如增殖細(xì)胞核抗原 (PCNA) 和復(fù)制蛋白 A (RPA)，為 SIRF 的靈敏度比正常值高得多提供證據(jù)免疫熒光以及如何可靠地量化所研究的蛋白質(zhì)與新生 DNA 的相互作用。實驗人員驗證了先前使用 iPOND 技術(shù)獲得的發(fā)現(xiàn)，例如將 MRE11 核酸酶募集到叉的要求。 他們還對 53BP1 丟失對復(fù)制叉關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用的影響帶來了新的見解。 敏感的 SIRF 方法在所有測試場景中都發(fā)揮了作用，有望在未來幾年內(nèi)對復(fù)制叉進(jìn)行研究。

由于幾個原因，SIRF 方法值得注意。  首先，SIRF 幾乎不需要起始材料（每個條件約 10,000 個細(xì)胞），但其高靈敏度允許檢測在不受干擾的條件下 IF 無法觀察到的因素，例如 RPA 和 RAD52。  其次，通過改變實驗條件，當(dāng) EdU 被少量胸苷趕走時，可以研究停滯或折疊叉處相同蛋白質(zhì)的數(shù)量，或復(fù)制叉后面的募集。  最后，SIRF 可以與異質(zhì)細(xì)胞群中的其他 IF 參數(shù)結(jié)合使用，例如細(xì)胞周期標(biāo)記、早期或晚期復(fù)制細(xì)胞的染色以及特定受體的存在。   這種單細(xì)胞分辨率功能，在測量細(xì)胞群平均值的方法中不存在，使人們能夠了解蛋白質(zhì)與復(fù)制叉的相互作用如何受到影響或與細(xì)胞群環(huán)境中的其他參數(shù)相關(guān)聯(lián)。

新 SIRF 技術(shù)為回答幾個重要問題開辟了道路。 例如，復(fù)制體和 DNA 代謝因子（如 RPA、RAD51、RAD52 和 MRE11）在未受挑戰(zhàn)的復(fù)制和停滯的分叉期間無法通過常規(guī) IF 檢測到，但它們可以通過 SIRF 輕松檢測到，支持其他依賴鹵化的敏感技術(shù)的結(jié)果特定蛋白質(zhì)的 DNA pulldown 和蛋白質(zhì)印跡分析和 iPOND 結(jié)果。 鑒于 SIRF 的準(zhǔn)確性和高靈敏度，用一組能夠結(jié)合暴露在新復(fù)制 DNA 尖端的單鏈 DNA (ssDNA) 的蛋白質(zhì)來解決復(fù)制叉相互作用中的面板變化，并將這些變化與據(jù)報道，在相同的實驗條件和細(xì)胞系中，在叉處發(fā)生 DNA 轉(zhuǎn)變。 由于提議用于介導(dǎo)特定 DNA 轉(zhuǎn)換的用于檢測翻譯后修飾的蛋白質(zhì)的抗體可能可用，當(dāng)與其他方法結(jié)合使用時，SIRF 可以提供有關(guān)蛋白質(zhì)修飾動態(tài)、與新生 DNA 的相互作用以及復(fù)制叉處的 DNA 轉(zhuǎn)換的有用信息. 此外，由于它能夠檢測不屬于復(fù)制體通常成分但后來在復(fù)制叉后部關(guān)聯(lián)的因子——可能在暴露于新生 DNA 附近的 ssDNA 區(qū)域或新生 DNA 本身——SIRF 具有潛力為了幫助揭示可能促進(jìn)復(fù)制后修復(fù)的因素，這個話題仍然鮮為人知，尤其是在哺乳動物細(xì)胞中。 當(dāng)與提供染色質(zhì)狀態(tài)以及某些基因組區(qū)域（如著絲粒或端粒）信息的表觀遺傳標(biāo)記和特定結(jié)合物的 IF 相結(jié)合時，SIRF 有望為 DNA 復(fù)制如何在全球或特定基因組區(qū)域和不同區(qū)域的調(diào)控提供答案。

總之，SIRF 技術(shù)為理解局部蛋白質(zhì)-復(fù)制叉相互作用如何導(dǎo)致復(fù)制叉結(jié)構(gòu)和染色體結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化開辟了新途徑。  這些問題對于理解與染色體復(fù)制相關(guān)的基本 DNA 代謝過程和監(jiān)測臨床環(huán)境中復(fù)制叉的關(guān)鍵相互作用非常重要。