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調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄后命運的真核 RNA 分子的兩個特征是 RNA 二級結(jié)構(gòu)和 RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 相互作用位點。然而，從未獲得對紅細胞生成過程中這些序列特征的動態(tài)性質(zhì)的全面全局概述。在這里，我們使用我們的核糖核酸酶介導的結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合位點映射方法來揭示 RNA 二級結(jié)構(gòu)和 RBP-RNA 相互作用位點的全球景觀，以及在這一重要發(fā)展過程中這些特征的動態(tài)。我們在整個過程中確定了 RNA 二級結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合的動態(tài)模式，并確定了一組相應(yīng)的蛋白質(zhì)結(jié)合序列基序及其動態(tài)結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合背景。最后，使用這些動態(tài)結(jié)合序列，我們確定了許多在哺乳動物紅細胞生成過程中在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中具有已知和假定關(guān)鍵功能的 RBP?？偟膩碚f，這項全球分析揭示了哺乳動物血細胞發(fā)育的新轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)劑。

在真核系統(tǒng)中，RNA 結(jié)合蛋白 (RBP) 從合成到衰變與 RNA 相互作用，從而增加了轉(zhuǎn)錄組的復雜性。最近的一項完整的 mRNA RBPome 研究在 HeLa 細胞中鑒定了數(shù)百個 RBP，這些 RBP 能夠在確定 RNA 功能方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。 這些功能包括一系列轉(zhuǎn)錄后過程，包括剪接、聚腺苷酸化、核輸出、定位、運輸、翻譯和降解。

已顯示 RBP 以序列和 RNA 二級結(jié)構(gòu)特異性方式與其結(jié)合靶標相互作用。 在過去十年中出現(xiàn)了幾種高通量方法來解決 RNA 結(jié)合蛋白、它們的目標和 RNA 二級結(jié)構(gòu)之間的相互作用。 這些技術(shù)通常使用化學探針或結(jié)構(gòu)特異性 RNases（單鏈 RNases (ssRNases) 和雙鏈 RNases [dsRNases]）來提供單鏈或雙鏈結(jié)構(gòu)區(qū)域的位點特異性證據(jù) 。

迄今為止，已知的 RBP-RNA 相互作用位點庫是建立在逐個蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上的，研究確定了單個感興趣的蛋白質(zhì)的靶標，通常通過使用交聯(lián)和免疫沉淀測序 (CLIP -seq)。在 CLIP-seq 中，樣品被紫外線照射以誘導蛋白質(zhì)與其 RNA 靶標的交聯(lián)。 隨后用抗體進行免疫沉淀會拉下蛋白質(zhì)和結(jié)合的 RNA 片段，然后對這些片段進行測序并映射回轉(zhuǎn)錄組。 例如，該技術(shù)用于識別整個轉(zhuǎn)錄組中的 PABPC1 結(jié)合位點，并且該研究進一步證明了 5' UTR PABPC1 相互作用位點介導了對結(jié)合目標轉(zhuǎn)錄本的翻譯控制。與這種有針對性的方法相比，我們最近報道了蛋白質(zhì)相互作用譜測序 (PIP-seq) 的方法，該方法允許對感興趣的樣本中的 RBP-RNA 相互作用位點進行全局和無偏見的分析。 在 PIP-seq 中，RNA-蛋白質(zhì)相互作用通過甲醛交聯(lián)穩(wěn)定，然后使用蛋白酶、ssRNase 和 dsRNase 處理的組合進行詢問。 這種方法創(chuàng)建了一組正交文庫，能夠同時闡明整個目標轉(zhuǎn)錄組中的 RNA 二級結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)結(jié)合序列。

對哺乳動物紅細胞生成的研究表明，該過程涉及基因表達的一系列復雜且具有階段特異性的變化。 成熟的紅細胞來源于造血干細胞和祖細胞，它們經(jīng)歷了一系列越來越嚴格的譜系定型事件。 重要的是，這個過程包括對轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程的嚴重依賴，尤其是在其終端步驟 。 終末紅細胞生成包括細胞大小減少、血紅蛋白生成增加、膜重組、染色質(zhì)凝聚，最后是去核。 雖然分化的每個階段也表現(xiàn)出階段特定的轉(zhuǎn)錄組，但 RNA 二級結(jié)構(gòu)和 RBP 結(jié)合位點動力學對該過程的貢獻以前尚未在全球范圍內(nèi)進行過探索。

在這里，通過對小鼠紅細胞白血病 (MEL) 細胞進行 PIP-seq，我們確定了 RBP 結(jié)合位點，提供了對 RNA 二級結(jié)構(gòu)的全轉(zhuǎn)錄組觀察，并在紅細胞的終末階段分析了這些 RNA 特征及其相互作用發(fā)展。  我們的結(jié)果對哺乳動物紅細胞發(fā)育的終末階段發(fā)生的 RBP 結(jié)合事件和 RNA 二級結(jié)構(gòu)變化產(chǎn)生了公正的看法。   此外，這些數(shù)據(jù)集為未來研究結(jié)合 RNA 區(qū)域和 RNA 二級結(jié)構(gòu)對細胞分化這一關(guān)鍵過程的功能重要性提供了資源。