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標(biāo)題：METTL14-mediated N6-methyladenosine modification of SOX4 mRNA inhibits tumor metastasis in colorectal cancer.

期刊：Molecular Cancer

影響因子：10.679

關(guān)鍵詞：METTL14，SOX4，H3K4me3，YTHDF2，結(jié)直腸癌

主要技術(shù)方法：轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq），m6A RNA免疫沉淀測序（MeRIP-Seq），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR），RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)等。

      結(jié)直腸癌（CRC）的主要死亡原因是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。甲基轉(zhuǎn)移酶樣蛋白14(METTL14)是一種主要的RNA N6-腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶，通過調(diào)節(jié)RNA功能參與腫瘤發(fā)展。本研究旨在揭示METTL14在CRC中的生物學(xué)功能及其分子機(jī)制。

       2020年6月，南京市第一醫(yī)院綜合臨床研究中心的研究人員發(fā)現(xiàn)CRC中METTL14的表達(dá)下調(diào)且與總生存率差有關(guān)。KDM5C介導(dǎo)了METTL14啟動子區(qū)域的H3K4me3，抑制了METTL14的轉(zhuǎn)錄。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明METTL14抑制CRC細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移。METTL14可介導(dǎo)SOX4的m6A修飾，抑制其表達(dá)，該過程依賴于YTHDF2通路。 METTL14可能通過SOX4介導(dǎo)的EMT過程和PI3K/Akt信號部分抑制CRC的惡性過程。

1.    METTL14在CRC中低表達(dá)并促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和發(fā)展
數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)METTL14在CRC中表達(dá)下調(diào)，qRT-PCR和IHC對臨床樣本的進(jìn)一步檢測表明，METTL14在CRC中顯著下調(diào)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)，低水平的METTL14患者表現(xiàn)出更差的生存期，暗示METTL14可能是一個獨(dú)立的CRC預(yù)后指標(biāo)。

2.    KDM5C介導(dǎo)的H3K4me3去甲基化抑制了METTL14的轉(zhuǎn)錄
通過對ENCODE中H3K4me3的CHIP-Seq數(shù)據(jù)查詢發(fā)現(xiàn)，CRC細(xì)胞中H3K4me3在啟動子區(qū)域的富集明顯低于正常結(jié)直腸組織，KDM5C mRNA在CRC組織中顯著上調(diào)，且與METTL14的水平呈負(fù)相關(guān)（已知KDM5C可催化H3K4me2/3去甲基化，抑制基因轉(zhuǎn)錄）。實(shí)驗(yàn)證明，KDM5C水平下降時，METTL14的RNA和蛋白水平均顯著升高。KDM5C和H3K4me3的ChIP-qPCR結(jié)果均顯示METTL14啟動子區(qū)被顯著富集，當(dāng)干擾KDM5C后，可以明顯增加METTL14啟動子區(qū)的H3K4me3信號；因此推測KDM5C介導(dǎo)的H3K4me3去甲基化可能是引起METTL14表達(dá)下降的原因。

3.    METTL14抑制CRC細(xì)胞遷移和侵襲
對CRC細(xì)胞的qPCR檢測再次確認(rèn)了METTL14在CRC細(xì)胞中的低表達(dá)。細(xì)胞transwell和CRC細(xì)胞移植小鼠實(shí)驗(yàn)表明，METTL14高表達(dá)時，細(xì)胞遷移、侵襲及腫瘤轉(zhuǎn)移力下降，METTL14低表達(dá)時結(jié)果相反。

4.    SOX4是METTL14的下游靶標(biāo)
通過對sh-METTL14細(xì)胞的RNA-seq及MeRIP-seq檢測，找到了在2組數(shù)據(jù)中重疊的25個轉(zhuǎn)錄本，并從中發(fā)現(xiàn)了已知的癌基因SOX4。RNA-seq結(jié)果顯示，當(dāng)METTL14敲低時，SOX4顯著上調(diào)。MeRIP-seq結(jié)果顯示，SOX4 mRNA的終止密碼子附近檢測到m6A峰，其在METTL14干擾時全部降低，暗示SOX4可能是METTL14介導(dǎo)的m6A修飾的下游靶標(biāo)。數(shù)據(jù)庫信息和qPCR/IHC實(shí)驗(yàn)證據(jù)均表明METTL14的表達(dá)與SOX4的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

5.    METTL14通過m6A-YTHDF2依賴性途徑抑制癌基因SOX4
MeRIP-qPCR確認(rèn)了metl14過表達(dá)或干擾能顯著增加或降低SOX4的m6A豐度。SOX4野生和突變（無法進(jìn)行m6A修飾）載體的熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示，METTL14干擾只增加了SOX4野生型的轉(zhuǎn)錄水平，而不影響突變型，說明SOX4水平受METTL14相關(guān)m6A修飾的調(diào)控。qPCR檢測確認(rèn)了穩(wěn)定干擾METTL14能顯著促進(jìn)SOX4的前體和成熟體的RNA水平。用放線菌素D處理sh-METTL14細(xì)胞及對照細(xì)胞以阻斷轉(zhuǎn)錄，結(jié)果顯示SOX4前體和成熟mRNA在對照細(xì)胞中的半衰期明顯短于在sh-METTL14細(xì)胞中的半衰期，表明m6A的修飾可能觸發(fā)了SOX4前體的剪接和成熟體的降解。

據(jù)報道，YTHDF1/2/3作為m6A閱讀器家族。YTHDF1/2/3的shRNA干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，只有干擾YTHDF2時顯著增加了SOX4的表達(dá)。YTHDF2抗體的RNA免疫共沉淀（RIP-qPCR）實(shí)驗(yàn)證實(shí)了SOX4是YTHDF2的靶標(biāo)。以上結(jié)果表明，METTL14介導(dǎo)的m6A修飾通過依賴于YTHDF2的mRNA降解抑制了SOX4的表達(dá)。

6.    METTL14通過SOX4介導(dǎo)的EMT過程和PI3K/Akt信號抑制結(jié)直腸癌的惡性過程
過表達(dá)/干擾實(shí)驗(yàn)研究了SOX4在CRC中的致癌作用，transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，SOX4干擾抑制了CRC的遷移和侵襲。接著細(xì)胞和小鼠實(shí)驗(yàn)探討了METTL14和SOX4的關(guān)系，在METTL14過表達(dá)條件下再過表達(dá)SOX4時，SOX4過表達(dá)部分恢復(fù)了被METTL14上調(diào)抑制的細(xì)胞/腫瘤轉(zhuǎn)移能力。

據(jù)報道，SOX4控制TGF-β誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。本研究發(fā)現(xiàn)METTL14缺失促進(jìn)EMT，而SOX4沉默可以逆轉(zhuǎn)該促進(jìn)作用，說明METTL14通過抑制SOX4介導(dǎo)的EMT過程影響細(xì)胞遷移和侵襲。

另據(jù)報道，SOX4還是MAPK、PI3K-Akt和Wnt信號的重要激活劑。本研究發(fā)現(xiàn)METTL14敲除激活了PI3K/Akt信號通路，而SOX4沉默部分逆轉(zhuǎn)了該激活作用。LY294002是一種已知的PI3K化學(xué)抑制劑，可阻斷PI3K/Akt信號，LY294002處理后細(xì)胞的p-Akt水平降低，細(xì)胞遷移和侵襲能力也大大降低，表明METTL14通過抑制SOX4介導(dǎo)的PI3K/Akt途徑發(fā)揮功能。

本研究發(fā)現(xiàn)了新的METTL14/SOX4信號軸，其闡明了其對結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的影響，這將對進(jìn)一步的結(jié)直腸癌研究和治療提供幫助。