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原標(biāo)題：Peptide SMIM30 promotes HCC development by inducing SRC/YES1 membrane anchoring and MAPK pathway activation.
期刊：Journal Of Hepatology
影響因子：18.946
關(guān)鍵詞：lncRNA翻譯，LINC00998，SMIM30，SRC，YES1，肝細(xì)胞癌
主要技術(shù)方法：質(zhì)譜檢測(cè)（LC-MS/MS），RNA免疫共沉淀（RIP-Seq），染色免疫共沉淀（ChIP-qPCR），雙熒光素酶報(bào)告基因，免疫共沉淀（CoIP-MS），RNA-seq等。

除了典型的蛋白質(zhì)編碼基因之外，很多非編碼RNA（例如lncRNA）能夠影響細(xì)胞過(guò)程，在各種人類癌癥中也經(jīng)常觀察到lncRNA的水平失調(diào)。雖然lncRNA最早被認(rèn)為是一種非編碼RNA，但近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，一些lncRNA含有小的開(kāi)放閱讀框(SmORF)，并且其編碼的小肽具有生物學(xué)功能。

2020年5月，上海第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院的研究人員發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的LINC00998編碼一種內(nèi)源性小肽“SMIM30”，該小肽（非RNA）可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)肝細(xì)胞癌（HCC）腫瘤發(fā)生，其水平與HCC患者的不良生存率相關(guān)。SMIM30由c-Myc轉(zhuǎn)錄，然后驅(qū)動(dòng)非受體酪氨酸激酶SRC/YES1的膜錨定，進(jìn)而激活下游MAPK信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。該研究不僅揭示了ncRNA編碼的多肽促進(jìn)肝癌發(fā)生的新機(jī)制，而且提示這些多肽可以作為肝癌治療的新靶點(diǎn)和肝癌診斷和預(yù)后的新生物標(biāo)志物。

1.    發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中高表達(dá)的LINC00998編碼內(nèi)源性小肽“SMIM30”
使用核糖體蛋白S6(RPS6)抗體對(duì)4種癌細(xì)胞進(jìn)行RNA免疫共沉淀和高通量測(cè)序(RIP-Seq)，發(fā)現(xiàn)4種癌細(xì)胞中同時(shí)富集到的lncRNA共105個(gè)。通過(guò)潛在編碼框(SmORF)分析、CPC編碼潛能預(yù)測(cè)、GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)分析和新鮮冷凍組織的PCR，發(fā)現(xiàn)具有編碼潛能的LINC00998在HCC和癌旁組織中差異表達(dá)。RIP-qPCR再次確認(rèn)了LINC00998可以結(jié)合RPS6，說(shuō)明LINC00998可能定位于活躍翻譯的核糖體，潛在編碼一種功能肽。數(shù)據(jù)庫(kù)查找發(fā)現(xiàn)，LINC00998的潛在編碼肽收錄在uniprot中，命名為“SMIM30”，但缺乏多肽表達(dá)的證據(jù)及功能信息。PCR結(jié)果顯示LINC00998末端具有polyA結(jié)構(gòu)。外源載體構(gòu)建和細(xì)胞表達(dá)檢測(cè)，以及內(nèi)源SMIM30抗體調(diào)取和LC-MS/MS分析，都確認(rèn)了SMIM30肽的表達(dá)。免疫熒光和WB實(shí)驗(yàn)表明SMIM30蛋白定位于細(xì)胞膜上，可能是一種保守的疏水膜肽。

2.    SMIM30肽通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)HCC進(jìn)程
接下來(lái)，通過(guò)shRNA慢病毒抑制了HCC細(xì)胞中LINC00998和SMIM30的水平。CCK8、transwell、流式周期檢測(cè)等細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，LINC00998/SMIM30下調(diào)干擾了細(xì)胞周期，抑制了細(xì)胞的增殖和遷移。為了確定這一效應(yīng)是由LINC00998的RNA水平改變導(dǎo)致，還是由于編碼多肽的減少導(dǎo)致，作者構(gòu)建了起始密碼子突變而不能表達(dá)SMIM30的載體。功能回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)顯示，smORF突變的載體不能彌補(bǔ)LINC00998干擾的效應(yīng)，說(shuō)明LINC00998的編碼肽SMIM30，而不是其lncRNA，促進(jìn)了HCC細(xì)胞的惡性行為。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，SMIM30敲除組的小鼠腫瘤更小，肺轉(zhuǎn)移也更少。這些結(jié)果表明LINC00998編碼的SMIM30肽通過(guò)正向調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)HCC發(fā)展。

3.    SMIM30肽與受體酪氨酸激酶SRC/YES1相互作用
為了確定SMIM30肽的作用機(jī)制，在表達(dá)flag- SMIM30的細(xì)胞中用flag抗體做CoIP-MS，篩選到了與SMIM30相互作用的蛋白質(zhì)——非受體酪氨酸激酶SRC/YES1。LINC00998敲除并沒(méi)有改變SRC和YES1的蛋白水平，但使其磷酸化水平發(fā)生了變化，SMIM30的轉(zhuǎn)染又逆轉(zhuǎn)了這一變化，說(shuō)明SRC/YES1的激活狀態(tài)與SMIM30的表達(dá)水平有關(guān)。另外，它們之間的相互作用不受RNase處理的影響，表明這種互作不依賴于RNA。內(nèi)源性的Co-IP實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了它們之間的結(jié)合，免疫熒光也顯示SRC/YES1和SMIM30肽在細(xì)胞質(zhì)外緣共定位。之后，作者構(gòu)建了一系列的SRC/YES1結(jié)構(gòu)域突變載體，最終確定SRC/YES1的N端膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)λ鼈兣cSMIM30肽之間的互作是必需的。

4.    SMIM30肽激活MAPK信號(hào)通路并受到c-myc調(diào)控
接下來(lái)，研究者對(duì)SMIM30沉默的HCC細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq），GO分析表明，一些差異基因富集在膜靶向蛋白和膜錨定蛋白條目中。KEGG pathway分析表明一些差異基因富集在MAPK信號(hào)通路中。通過(guò)SMIM30敲除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)MAPK通路下游一些基因的磷酸化水平發(fā)生了變化，SMIM30-ORF的加入會(huì)逆轉(zhuǎn)這種變化。作用采用Co-IP方法進(jìn)一步確定了SMIM30、SRC/YES1和MAPK通路之間的關(guān)系，SMIM30起銜接SRC/YES1和integrin β1的作用（integrin β1介導(dǎo)MAPK通路），當(dāng)SMIM30低表達(dá)時(shí)，SRC/YES1和integrin β1之間的結(jié)合減弱。此外，作者利用JASPAR工具預(yù)測(cè)了可能結(jié)合SMIM30啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄因子——c-myc。ChIP實(shí)驗(yàn)表明c-Myc可以和預(yù)測(cè)的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合，雙熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)c-Myc能增強(qiáng)SMIM30的轉(zhuǎn)錄。