用于hPSC基因編輯的新方法產(chǎn)生高達84%的敲除效率

發(fā)布時間：2022-09-13 14:30:27作者：輝駿生物-fitgene

賓夕法尼亞州立大學領導的跨學科研究團隊開發(fā)了提高 CRISPR-Cas9 效率的技術，該基因組編輯技術在 2020 年獲得了諾貝爾獎。雖然 CRISPR-Cas9 比其他基因編輯更快、更便宜、更準確方法，根據(jù)賓夕法尼亞州立大學生物醫(yī)學工程和生物學副教授、項目負責人Lian 的說法，該技術有局限性，特別是在改善人類健康的應用中。

研究人員開發(fā)了一種更有效、更容易獲得的方法，將 CRISPR-Cas9 系統(tǒng)應用于人類多能干細胞 (hPSC)，該系統(tǒng)來源于聯(lián)邦政府批準的干細胞系，Lian 表示，這可以極大地推進遺傳疾病的診斷和治療。該方法于 9 月 7 日發(fā)表在《Cell Reports Methods》上。

CRISPR-Cas9 代表成簇的定期間隔短回文重復和 CRISPR 相關蛋白 9，使科學家能夠靶向遺傳密碼的精確位置以改變 DNA，從而提供創(chuàng)造新診斷工具和可能糾正突變以治療遺傳原因的機會的疾病。

CRISPR 使用稱為質(zhì)粒 DNA 的遺傳物質(zhì)盤來傳遞引導的核糖核酸 (RNA)，將 Cas9 酶定位在目標基因的精確位置。當 DNA 被定位時，Cas9 與其結合并將其切斷，從而允許其他 DNA 修復切割。然后研究人員可以看到去除如何改變基因的表達。但 Lian 表示，目前基于 DNA 的 CRISPR 方法存在交付和編輯效率問題。

DNA CRISPR 效應器的交付率很低，當使用 CRISPR 時，只有 20% 到 30% 的目標細胞會接受基因編輯 DNA。將 RNA 遞送到細胞中可以更有效；但是，當引入常規(guī) RNA 時，細胞可以將其視為病毒。它們會破壞RNA 在它可以制造蛋白質(zhì)之前，比如說，在幾個小時內(nèi) - 并且這樣做會破壞基因編輯的嘗試。

為了改善結果，研究人員使用修飾的 RNA (modRNA) 改變了將基因組編輯工具傳遞給干細胞的方式。 modRNA 與質(zhì)粒 DNA 的不同之處在于它用化學修飾的形式取代了 RNA 中發(fā)現(xiàn)的一種基礎底物，并且通過更強的結構支持來穩(wěn)定它。

發(fā)現(xiàn) modRNA 比質(zhì)粒 DNA 更有效，大約 90% 的細胞通過簡單的轉(zhuǎn)染獲得了 modRNA，因此它能夠保持原位并完成其工作。研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA 存在的時間是理想的：足夠長以修飾細胞，但又不會太長以至于導致脫靶活動。但據(jù) Lian 說，modRNA 引入了另一個問題。

當 modRNA Cas9 成功傳遞到目標基因時，它會在基因組中產(chǎn)生雙鏈斷裂，一些細胞會嘗試修復它。那些自我修復的人可以將修復或“突變”傳遞給他們的后代。這是研究人員想要更好地理解的過程，因此這些是他們想要收獲和研究的細胞。 Lian 說，問題在于大多數(shù)有這種斷裂的細胞將其視為基因組的一個主要問題，并且會自我毀滅而不是試圖自我修復。

為了減少 Cas9 的毒副作用并幫助編輯后的細胞存活，Lian 的團隊引入了一種已知有助于細胞生長的小蛋白質(zhì)。據(jù) Lian 介紹，這種添加的蛋白質(zhì)抑制了細胞死亡，并將 Cas9 編輯效率提高了 84%。

研究人員還發(fā)現(xiàn)，modRNA 可以改進其他基因編輯技術，例如堿基編輯。堿基編輯可以通過使用蛋白質(zhì)改變單個核苷酸而不是像 CRISPR 那樣切割兩條鏈來敲除基因或糾正基因組中的突變。

“我們用基于質(zhì)?；蚧?modRNA 的堿基編輯蛋白轉(zhuǎn)染干細胞，”Lian 說。 “我們基于 modRNA 的方法在成功編輯基因組方面的效率是基于質(zhì)粒的技術（大約 16%）的四倍多，達到 68%。”

Lian 表示，隨著更多基因編輯實驗室提高基因編輯效率和有效性，研究人員將能夠更快地更好地了解基因及其功能。人體有 20,000 多個基因，但我們只研究了其中約 10% 的功能，一次一個地檢查每個剩余基因的目的可能需要一生的時間。使用來自我們高效基因編輯技術的工程干細胞可以大大加快這一過程。

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