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單細胞基因組測序目前主要有兩種擴增方法：MALBAC方法及MDA方法，而單細胞轉(zhuǎn)錄組目前主要有三種方法：SMART擴增技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。今天主要和大家比較下單細胞轉(zhuǎn)錄組測序的三種常用方法。

一、SMART擴增技術(shù)：

SMART技術(shù)的出現(xiàn)是一個新的里程碑。這個稱作Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript(SMART)，原理實際上非常簡單：在合成cDNA的反應(yīng)中事先加入的3’末端帶Oligo（dG）的SMART引物，由于逆轉(zhuǎn)錄酶以mRNA為模板合成cDNA，在到達mRNA的5’末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結(jié)構(gòu)”，即甲基化的G時會連續(xù)在合成的cDNA末端加上幾個（dC），SMART引物的Oligo（dG）與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板，逆轉(zhuǎn)錄酶會自動轉(zhuǎn)換模板，以SMART引物作為延伸模板繼續(xù)延伸cDNA單鏈直到引物的末端，這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于有5’帽子結(jié)構(gòu)的mRNA才能利用這個反應(yīng)得到能擴增的cDNA，因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。

這個專利的方法是利用逆轉(zhuǎn)錄酶內(nèi)源的末端轉(zhuǎn)移酶活性，只要單管，一步即可完成，不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀，或者額外的酶反應(yīng)，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質(zhì)量、高產(chǎn)量的cDNA庫，更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度，可以應(yīng)用于直接擴增基因、構(gòu)建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA（RACE），和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。

通過SMART技術(shù)得到的主要是mRNA信息，LncRNA信息大部分會丟失，SMART技術(shù)對于RNA的質(zhì)量要求較高，如果RNA出現(xiàn)降解會導致mRNA 5’端信息丟失。通用引物技術(shù)能保證擴增的均一性，但PCR引入的突變不能夠分析出來。

二、10×genomics技術(shù)：

作為單細胞測序的另一個重要里程碑，10x genomic公司于2016年2月推出10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution，此平臺整合了儀器、試劑盒和信息學軟件，能全面對接illumina測序儀，因此可實現(xiàn)大量大細胞的快速高效標記、測序和分析，獲得單細胞水平的基因表達譜和差異情況，并通過對復雜細胞群體進行深入細致分析，繪制大規(guī)模單細胞表達圖譜。

介紹10X Genomics技術(shù)流程前，首先介紹Gel bead（凝膠磁珠）。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構(gòu)成，首先在凝膠微珠上種上特定的DNA片段，DNA片段由三部分組成：Barcode、UMI、PolyT組成。Barcode是16個堿基的長度。一共有400萬種Barcode，一個微珠是對應(yīng)于一種Barcode，通過這400萬種Barcode，可以把凝膠微珠給區(qū)分開。UMI是一段隨機序列，也就是說每一個DNA分子，都有自己的UMI序列。10個堿基長的UMI，有100萬種序列的變化（4^10  = 1,048,576），UMI的作用是為了區(qū)分哪些哪些reads是來自于一個原始cDNA分子，區(qū)分基因片段重復還是duplication及區(qū)分是真實的SNP位點還是PCR產(chǎn)生的突變。

通過10×genomics儀器將單個細胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起，形成油包水的小微滴，接下來把細胞膜破掉，讓細胞當中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合，也就是和逆轉(zhuǎn)錄酶、結(jié)合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸。

接著，發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。mRNA與凝膠微珠上帶標簽的DNA分子相結(jié)合，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，逆轉(zhuǎn)錄出cDNA來。把這個乳濁液當中所有的水相抽出來，也就是把所有帶了標簽的cDNA分子都抽出來，再把這些cDNA分子都加上接頭，經(jīng)過PCR擴增，做成illumina的測序文庫，放到Illumina的測序儀上進行測序。測序完成之后，進行數(shù)據(jù)分析。

10×genomics技術(shù)一次可以同時得到大量大細胞數(shù)據(jù)，但只能得到mRNA信息，LncRNA大部分信息丟失，UMI技術(shù)能很好去除認為分析引入duplication及PCR引入SNP位點。同樣對RNA質(zhì)量要求高，降解同樣會引起5’端信息丟失。

三、Anydeplete 技術(shù)

Anydeplete技術(shù)首先通過隨機引物進行一鏈合成，一鏈合成引入核苷酸類似物，用于酶切打斷，二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭，接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物，用于酶切降解。當形成單鏈文庫后，設(shè)計特異性引物與rRNA形成文庫結(jié)合，一輪退火延伸，rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。Reverse adaptor上帶有特異的酶切位點，當形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點被識別，切去接頭，這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭，而其他文庫帶有完整接頭，通過PCR擴增富積既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)一樣，包含分子標簽，可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點。

Anydeplete技術(shù)能夠用于降解性樣本，保證5’端及3’端信息的完整，能同時得到mRNA及LncRNA信息，如果只希望得到mRNA信息，Anydeplete技術(shù)則會引起一部分數(shù)據(jù)浪費。

應(yīng)用和優(yōu)勢對比：

SMART技術(shù)可用于單細胞mRNA測序，對RNA質(zhì)量要求高，RNA降解會引起5’端信息丟失，沒有分子標簽功能。

10×genomics技術(shù)可用于單細胞mRNA測序，對RNA質(zhì)量要求高，RNA降解會引起5’端信息丟失，有分子標簽功能。

Anydeplete技術(shù)可用于單細胞mRNA及LncRNA測序，對RNA質(zhì)量要求不高，可用于降解性樣本測序，有分子標簽功能。