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腺病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)步驟

腺病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)-實(shí)驗(yàn)?zāi)康模捍_定腺病毒感染目的細(xì)胞的最低病毒量,各個細(xì)胞株的腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率都不太一樣, 其中尤以淋巴細(xì)胞株最難轉(zhuǎn)導(dǎo)。

輝駿生物腺病毒感染目的細(xì)胞具體實(shí)驗(yàn)步驟:

1.    實(shí)驗(yàn)前一天收集處于對數(shù)生長期,生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞,用完全培養(yǎng)基稀釋至1×105cells/mL,接種于96孔板(至少接種15個孔的量),每孔接種100  μL上述細(xì)胞懸 液(即1×104 cells/well)。5% CO2、37 ℃ 二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。

2.    準(zhǔn)備12個無菌的1.5 mL EP管,分別加入180 μL的完全培養(yǎng)基。

3. 有限稀釋法稀釋病毒,從10-1~10-12:取20 μL腺病毒原液加入到第一個管的180 μL完全 培 養(yǎng)基中做1:10稀釋(10-1);然后以此為起點(diǎn),從第一個管取20 μL稀釋液到第二管 再做1:10稀釋(10-2),直至稀釋到10-12。

4.    從孵箱取出96孔板,顯微鏡下觀察確定細(xì)胞生長狀態(tài)均良好。吸掉孔內(nèi)舊的培養(yǎng)基, 按10-1~10-12的濃度梯度,依次加入100 μL的病毒稀釋液到接種有目的細(xì)胞的96孔板中, 每種濃度接種一孔,沒有加入病毒液的細(xì)胞孔中加入同樣體積的完全培養(yǎng)基作為對照 組。37  ℃,5%CO2二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

5.    6-12 h以后觀察細(xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與空白組無明顯差異,表明病毒對細(xì)胞無明 顯毒性反應(yīng),不要換液,繼續(xù)培養(yǎng)。

6.    由于腺病毒感染能力強(qiáng),請分別在感染后的12、24、48 h觀察細(xì)胞中的熒光表達(dá)情況。 綜合細(xì)胞生長狀態(tài)以及熒光表達(dá)量來判斷具有最佳作用效果的病毒稀釋度,并以此稀 釋度作為后續(xù)試驗(yàn)的依據(jù)。

注意: 在進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí),請選擇生長狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行感染,并根據(jù)適當(dāng)?shù)?MOI 值以確定好適宜的感染劑量,過高滴度的感染劑量會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性甚至死亡。若是 用于免疫實(shí)驗(yàn),請根據(jù)不同的動物和不同的免疫途徑確定合適的免疫劑量。

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