一：雙向電泳法

原理：雙向電泳一次可以從細(xì)胞、組織或其它生物樣本中分離上千種蛋白質(zhì)，凝膠上的斑點(diǎn)都對(duì)應(yīng)著樣品中的蛋白質(zhì)，且各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，分子量和含量的信息都能通過質(zhì)譜鑒定和軟件分析獲得。因此其在蛋白質(zhì)組分析、疾病標(biāo)志物檢測、細(xì)胞差異分析、藥物開發(fā)、癌癥研究等領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）經(jīng)典方法、應(yīng)用范圍廣、適用于各類材料；

（2）經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，可大規(guī)模多個(gè)樣本篩選和分析。

二：雙向熒光差異凝膠電泳（DIGE）法

原理：DIGE — 雙向熒光差異凝膠電泳，利用熒光染料（Cy2, Cy3, Cy5）能與蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基反應(yīng)而使蛋白質(zhì)被標(biāo)記，標(biāo)記后蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量基本不受影響，等量混合標(biāo)記好的蛋白質(zhì)后進(jìn)行雙向電泳，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化則通過不同熒光的強(qiáng)度來體現(xiàn)。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）高效性，同一塊凝膠上可以電泳兩個(gè)樣品，減輕了工作量；

（2）與常規(guī)銀染相比靈敏度更高；

（3）檢測動(dòng)態(tài)范圍更大；

（4）定量精確, 采用內(nèi)標(biāo)而消除了膠與膠之間的實(shí)驗(yàn)誤差；

（5）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，ImageMaster7.0（DIGE）軟件可以得到統(tǒng)計(jì)學(xué)可信的結(jié)果，降低了操作者之間的偏差。

三：化學(xué)標(biāo)記法—iTRAQ定量方法

原理：iTRAQ試劑是可與氨基酸末端氨基及賴氨酸側(cè)鏈氨基連接的胺標(biāo)記同重元素。在質(zhì)譜圖中，任何一種iTRAQ試劑標(biāo)記不同樣本中的同一蛋白質(zhì)表現(xiàn)為相同的質(zhì)荷比。 在串聯(lián)質(zhì)譜中，信號(hào)離子表現(xiàn)為不同質(zhì)荷比(113-119，121)的峰，因此根據(jù)波峰的高度及面積，可以鑒定出蛋白質(zhì)和分析出同一蛋白質(zhì)不同處理的定量信息。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）靈敏度高，檢測限低，可檢測出低豐度蛋白；

（2）分離能力強(qiáng),分析范圍廣,iTRAQ可以對(duì)任何類型的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，包括高分子量蛋白質(zhì)、酸性蛋白和堿性蛋白，膜蛋白和不溶性蛋 白；

（3）高通量：同時(shí)對(duì)8個(gè)樣本進(jìn)行分析，提高了實(shí)驗(yàn)通量，可同時(shí)對(duì)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)或不同處理的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析；

（4）結(jié)果可靠：定性與定量分析結(jié)果更加可靠；

（5）自動(dòng)化程度高：液相與質(zhì)譜連用，自動(dòng)化操作，分析速度快，分離效果好。

四：化學(xué)標(biāo)記法—ICAT法

原理：ICAT試劑結(jié)構(gòu)，包括3個(gè)部分，SH反應(yīng)集團(tuán)， biotin標(biāo)簽，同位素臂，試劑具有兩種形式：重型（含8個(gè)氘）和輕型（不含氘），來源不同處理的蛋白質(zhì)分別用重型ICAT試劑和輕型ICAT試劑標(biāo)記，標(biāo)記后等量混合，胰蛋白酶酶切，親和純化得到ICAT標(biāo)記的多肽，質(zhì)譜分析，依據(jù)MS質(zhì)譜峰圖強(qiáng)度進(jìn)行定量，MS/MS鑒定肽段。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）它不能用于標(biāo)記不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白質(zhì)；

（2）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），與蛋白質(zhì)連接后可能會(huì)造成分子的空間位阻；

（3）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），由于在MS分析中標(biāo)簽仍保留在每個(gè)肽上，使得在碰撞誘導(dǎo)解吸（CID)條件下，很容易被片段化，那么標(biāo)簽特異化的片段離子就會(huì)使串聯(lián)質(zhì)譜分析標(biāo)記肽段的過程復(fù)雜化；

（4）ICAT分子量相對(duì)較大（約500Da），這對(duì)小肽而言是一個(gè)較大的修飾物，會(huì)增加數(shù)據(jù)庫搜索的復(fù)雜性；

（5）標(biāo)記時(shí)通常需要延長時(shí)間來保證ICAT與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，這可能會(huì)造成賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸發(fā)生氨基酸局部衍化。

五：代謝標(biāo)記法—15N標(biāo)記法

原理：在培養(yǎng)基中添加15N，細(xì)胞經(jīng)過若干代培養(yǎng)后，蛋白質(zhì)將完全被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記與沒有標(biāo)記同位素的樣本、液相色譜和SDS-PAGE分離，質(zhì)譜鑒定和定量。根據(jù)質(zhì)譜譜圖中成對(duì)峰的面積之比可判斷出同一肽段在不同樣品中的含量變化，根據(jù)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）高效性：15N標(biāo)記法是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)95%；

（2）重現(xiàn)性：降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；

（3）靈活性：在培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記15N ，操作方便。

六：代謝標(biāo)記法—SILAC法

原理：SILAC即細(xì)胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC)，其基本原理是在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，采用含有輕、中、重同位素型必需氨基酸的培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，用于SILAC主要的穩(wěn)定同位素氨基酸是Lys和Arg, 細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中同位素氨基酸將被細(xì)胞用于合成蛋白質(zhì)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)5-6代后，細(xì)胞的所有蛋白質(zhì)將被同位素標(biāo)記，等量混合標(biāo)記的蛋白質(zhì)后經(jīng)過SDS-PAGE分離和質(zhì)譜分析，通過比較一級(jí)質(zhì)譜圖中三個(gè)同位素型肽段的面積大小進(jìn)行相對(duì)定量，同時(shí)二級(jí)譜圖對(duì)肽段進(jìn)行序列測定從而鑒定蛋白質(zhì)。

優(yōu)點(diǎn)：

（1）高效性：SILAC是體內(nèi)標(biāo)記技術(shù)，標(biāo)記效率可高達(dá)100%；

（2）定量精確：線性范圍廣，降低由于樣品制備不同而造成的實(shí)驗(yàn)內(nèi)差異；

（3）高通量、靈敏度高：可同時(shí)鑒定并定量數(shù)百至數(shù)千種蛋白質(zhì)，且檢可測測到納克級(jí)水平；

（4）相容性：可以對(duì)多種在DMEM或RPMI 1640培養(yǎng)基中能夠培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的蛋白進(jìn)行標(biāo)記；

（5）靈活性：在缺乏L-賴氨酸和L-精氨酸的培養(yǎng)基中添加同位素標(biāo)記的這兩種氨基酸，操作方便。