如何區(qū)別幾種不同蛋白互作實驗方法(IP/Co-IP/GST pull down)？

理論知識點看了多遍，但還是分不清IP，Co-IP，GST pull down？輝駿生物在下文除了介紹介紹IP與Co-IP區(qū)別知識要點，也將研究蛋白互作幾種方法（酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H），CO-IP的關(guān)系，GST-Pull Down）之間的區(qū)別以及優(yōu)缺點簡明扼要的收納進來。

獨角戲——IP:

免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）就是用偶聯(lián)相應抗體的磁珠把你要研究的蛋白X免疫沉淀下來，然后去檢測它。例如蛋白X在細胞內(nèi)的蛋白量不同，或者有著不同的翻譯后修飾，這時就可以用X蛋白抗體+Prorein A beads來進行IP，從細胞中把蛋白X拉下，再用特異的抗體（如磷酸化，泛素化抗體）進行WB來檢測蛋白X的變化。簡言之，IP就是檢測單個蛋白的狀態(tài)（高矮胖瘦，有沒有戴帽子，穿的什么衣服等等）。

免疫沉淀

眾里尋她千百度——酵母雙雜交系統(tǒng)（Y2H）：

酵母雙雜交系統(tǒng)的建立是基于對真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程的認識。真核生物中基因轉(zhuǎn)錄需要轉(zhuǎn)錄激活因子的參與，真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子含有兩個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DNA-BD）和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD），這兩個結(jié)構(gòu)域可以獨立分開，功能互不影響。BD和AD分別單獨作用并不能激活轉(zhuǎn)錄反應，只有當二者在空間上充分接近時，才呈現(xiàn)完整的轉(zhuǎn)錄激活因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。根據(jù)這一原理，可設(shè)計酵母雙雜交系統(tǒng)。

將兩待研究蛋白（蛋白 X 與蛋白 Y）分別與 BD、AD 結(jié)構(gòu)域構(gòu)建融合質(zhì)粒。將構(gòu)建好的兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一酵母細胞中表達，如果兩蛋白之間不存在相互作用，則下游基因（報告基因）不會轉(zhuǎn)錄表達；如果兩個蛋白間存在相互作用，則BD與AD兩結(jié)構(gòu)域空間上很接近，從而下游基因（報告基因）得以轉(zhuǎn)錄。通過報告基因表達與否，即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

通常在現(xiàn)實情況中，與蛋白X存在潛在互作可能的候選蛋白會有好幾種（Y，Z，A，B等），這時我們就可以通過酵母雙雜交在體內(nèi)篩選與X有相互作用的蛋白Y。

酵母雙雜交系統(tǒng)

遇見愛情——Co-IP：

竟然我們在體內(nèi)驗證過，那么蛋白X和蛋白Y在體外是否也存在相互作用了？這個時候我們可以用到CoIP了~

免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）的原理和IP是一樣的，當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用被保留了下來，假如細胞內(nèi)存在 XY 蛋白復合物，用 X（X也稱為誘餌蛋白）的抗體免疫沉淀 X，那么與

X 在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì) Y（Y也稱為靶蛋白）也被沉淀下來。因此在細胞裂解液中加入 X 的抗體沉淀蛋白X，隨后利用蛋白印跡（western blot，WB）檢測沉淀中是否存在蛋白 Y，如果存在，則說明細胞內(nèi)存在XY蛋白復合物，即蛋白XY存在相互作用。（在體外驗證X和Y之間有聯(lián)系）

免疫共沉淀

免疫共沉淀（Co-IP）

在我們用酵母雙雜交和Ｃo-IP雙保險驗證X和Y之間確實存在相互作用后，我們發(fā)現(xiàn)酵母雙雜交和Ｃo-IP的結(jié)果都只能說明X和Y之間有相互作用，但并不能確定這種相互作用是直接的還是間接的，這個時候存在兩種可能：

X與Y之間存在直接的相互作用（X和Y自由戀愛一見鐘情）
也就是說也許是X與M相互作用，而Y也和M相互作用，這樣，用A的抗體可以把M拉下來，但同時M又把B也拉下來了（X和Y是通過他們共同的朋友M介紹才認識然后在一起的）

要想準確確定X和Y直接的作用到底是直接的還是間接的了，這個時候我們需要祭出我們大boss——GST pull down實驗~

GST pull down：

GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統(tǒng)的體外試驗技術(shù), 近年來越來越受到廣大學者的青睞。

原理：將靶蛋白和GST組成的融合蛋白固定在谷胱甘肽（GSH）親和樹脂上，作為與目的蛋白親和支撐物,充當一種“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”(目的蛋白)，洗脫結(jié)合物后通過SDS-PAGE電泳分析，從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白，“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得，此方法簡單易行，操作方便。

GST-Pull Down

如何選擇：

Co-IP，GST pull down和酵母雙雜交是研究蛋白互做最常用的三種方法，一般常用酵母雙雜交來篩選，用Co-IP和GST pull down用來驗證。研究不僅在整體蛋白層面，還包括蛋白的結(jié)構(gòu)域?qū)用?，GST pulldown是用來驗證蛋白X與Y是直接結(jié)合的，而Y2H和Co-IP結(jié)果則還有間接作用以及非特異性作用。

輝駿生物專業(yè)提供Co-IP免疫共沉淀、GST pull down、RNA pull down、DNA pull down等多種蛋白互作實驗，近十年服務經(jīng)驗，客戶成果發(fā)表在Nature Methods，Oncogene，Cell Research等高水平期刊上。自有蛋白質(zhì)組學平臺，對質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力，對后續(xù)的生物信息分析有獨到的見解；售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章，確?？蛻舭残倪M行下游實驗及投稿。