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多組氨酸標(biāo)記蛋白占常規(guī)重組蛋白表達(dá)和純化的 90% 以上。組氨酸標(biāo)簽與其他親和標(biāo)簽相比具有許多優(yōu)點(diǎn)，例如小尺寸、與 IMAC 樹脂結(jié)合的高親和力（固定金屬親和層析），并允許對(duì)重組蛋白進(jìn)行一步純化。 但有時(shí)組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)不會(huì)與親和柱結(jié)合并逃避它的捕獲和隨后的純化。 雖然這種情況并不常見，但無(wú)論何時(shí)發(fā)生都會(huì)令人非常沮喪。 但是，如果出現(xiàn)此類問(wèn)題，有一些方法可以進(jìn)行故障排除，輝駿生物下面將逐步討論解決方案。 

您的增溶緩沖液是否需要優(yōu)化？  

Ni-NTA 樹脂對(duì)還原劑（如 DTT）和螯合劑（如 EDTA 或 EGTA）的存在很敏感，請(qǐng)確保增溶緩沖液中不含任何這些物質(zhì)，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響 IMAC 樹脂的結(jié)合能力。  

通常，蛋白質(zhì)溶解/結(jié)合緩沖液中的咪唑濃度保持在 15-25 mM 以防止非特異性蛋白質(zhì)與 IMAC 樹脂結(jié)合，建議檢查溶解緩沖液中的咪唑濃度，有時(shí)即使低咪唑濃度也可以防止結(jié)合將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到 Ni-NTA 樹脂上 。 在這種情況下，應(yīng)仔細(xì)嘗試較低的濃度，以免干擾蛋白質(zhì)與親和樹脂的結(jié)合。 另一個(gè)關(guān)鍵因素是增溶緩沖液的 pH 值。 當(dāng)增溶緩沖液的 pH 值較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致組氨酸側(cè)鏈質(zhì)子化，這會(huì)阻止組氨酸殘基與成功結(jié)合所需的金屬配位。 通常建議保持緩沖液的 pH 值接近蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 添加咪唑會(huì)降低 pH 值，因此建議在添加咪唑后調(diào)節(jié)結(jié)合/增溶緩沖液的 pH 值。 

您的親和樹脂新鮮有效嗎？  

為確保親和樹脂正常工作，請(qǐng)?jiān)谕痪彌_液中對(duì)帶有 His 標(biāo)簽的對(duì)照蛋白（之前已使用 IMAC 純化過(guò)的蛋白）與感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行批量結(jié)合。 如果對(duì)照蛋白質(zhì)與咪唑結(jié)合并洗脫，但您的目標(biāo)蛋白質(zhì)繼續(xù)出現(xiàn)在流通和柱洗滌中并且沒(méi)有洗脫，則是時(shí)候認(rèn)真起來(lái)尋找其他原因了。

首次嘗試純化新型蛋白質(zhì)時(shí)，請(qǐng)始終使用新鮮的 Ni-NTA。  

您的蛋白質(zhì)是否隱藏了組氨酸標(biāo)簽？  

某些蛋白質(zhì)可以在折疊的天然結(jié)構(gòu)中隱藏多組氨酸標(biāo)簽，從而阻止蛋白質(zhì)與 IMAC 親和柱的結(jié)合。 結(jié)果是 標(biāo)簽無(wú)法與金屬（通常是鎳或鈷）協(xié)調(diào)。 標(biāo)簽的不可接近性可能是由于標(biāo)簽被隱藏在折疊蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象中。 一種快速而可靠的方法是在溶解緩沖液中存在強(qiáng)變性劑（如尿素或氯化胍）的情況下進(jìn)行純化。 尿素和氯化胍都是強(qiáng)大的變性劑，會(huì)使蛋白質(zhì)展開，如果蛋白質(zhì)在這些變性劑存在的情況下與樹脂結(jié)合，則可以肯定地說(shuō)折疊的蛋白質(zhì)隱藏了他的標(biāo)簽并阻止了它與 IMAC 樹脂的結(jié)合。                

如何克服它？  

克服隱藏組氨酸標(biāo)簽問(wèn)題的方法有很多，其中一些方法如下：

1、在變性條件下純化蛋白質(zhì)，稍后再折疊。  

2、添加接頭序列以將蛋白質(zhì)與聚組氨酸標(biāo)簽與蛋白質(zhì)分開，通?？梢允褂镁劢z氨酸或聚甘氨酸的接頭。 該策略要求在克隆步驟進(jìn)行干預(yù)。靈活接頭的存在確保多組氨酸標(biāo)簽仍可用于與 IMAC 樹脂結(jié)合，并且不會(huì)被蛋白質(zhì)隱藏。  

3、最后的選擇是將 poly-His 標(biāo)簽放在相反的末端，看看這樣的交換是否允許 His 標(biāo)簽綁定到親和矩陣。  

通常這些策略之一會(huì)起作用，但如果它們?nèi)匀徊黄鹱饔茫敲纯梢允褂酶蟮挠H和標(biāo)簽，例如 GST 或 MBP，而不是小的組氨酸標(biāo)簽。