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聚合酶鏈反應(yīng) ( PCR )在現(xiàn)代分子生物學(xué)和分子醫(yī)學(xué)中產(chǎn)生了重大影響。因此，我們現(xiàn)在生活在 PCR 之后的時(shí)代，因?yàn)楝F(xiàn)在許多診斷測(cè)試都使用 PCR。下圖說(shuō)明了用于 PCR 的核酸模板的樣本來(lái)源以及衍生分析方法的樣本。 

可使用 DNA 或 cDNA (RNA) 進(jìn)行 PCR 分析。有多種來(lái)源可用于制備核酸模板，包括法醫(yī)樣品。PCR 現(xiàn)在形成了許多分析技術(shù)的基礎(chǔ)。大多數(shù)方法利用目標(biāo)序列的差異擴(kuò)增，但其他方法可能涉及 PCR 產(chǎn)物分析的高級(jí)應(yīng)用。 

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 是一種允許在實(shí)驗(yàn)室中使用現(xiàn)成的試劑對(duì)一段 DNA 進(jìn)行多次拷貝的技術(shù)。在反應(yīng)過(guò)程中，拷貝數(shù)呈指數(shù)增加。 因此，可以在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)制作超過(guò) 1000 億份 DNA 片段。 DNA聚合酶和合成寡核苷酸的可用性使這項(xiàng)技術(shù)成為可能。PCR 現(xiàn)在已成為克隆的替代方法，因?yàn)樗试S擴(kuò)增復(fù)雜混合物中的特定序列。此外，PCR 結(jié)合測(cè)序技術(shù)可以特異性、快速和高靈敏度地鑒定 DNA 樣品中的突變等位基因。 

PCR 技術(shù)允許從少量起始材料中特異性擴(kuò)增目標(biāo) DNA 序列。在早期版本的 PCR 中，使用了的 Klenow 片段 大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 。然而，Klenow 片段不是 熱穩(wěn)定 . 引入熱穩(wěn)定的 DNA 聚合酶，例如在 Thermus 中發(fā)現(xiàn)的 DNA 聚合酶 水生動(dòng)物 ，導(dǎo)致 PCR 方法發(fā)展的重大技術(shù)突破。 

PCR 可以根據(jù)技術(shù)的使用方式分為不同的組或方法。 但是，所有這些方法都遵循相同的基本步驟和原則。

圖 1：TAQ 聚合酶模型。 

研究人員用與聚合酶結(jié)合的平端雙鏈 DNA 解析了 Taq 聚合酶的共晶結(jié)構(gòu) 活性位點(diǎn) 裂縫。 該結(jié)構(gòu)表明 DNA 既不彎曲也不穿過(guò)大的聚合酶裂縫。結(jié)合 DNA 的結(jié)構(gòu)構(gòu)象介于 B 和 A 形式之間。 結(jié)構(gòu)模型顯示寬的小溝允許進(jìn)入蛋白質(zhì)側(cè)鏈。 側(cè)鏈在平端與嘌呤的 N3 和嘧啶的 O2 氫鍵連接。 

DNA聚合酶催化長(zhǎng)多核苷酸鏈的合成。 在原始親本 DNA 鏈的存在下，合成從單體脫氧核苷酸三磷酸開(kāi)始。DNA 鏈用作合成新的互補(bǔ) DNA 鏈的模板。合成沿 5' 到 3' 方向進(jìn)行。 聚合從脫氧核苷三磷酸的 5' α-磷酸酯到正在生長(zhǎng)的 DNA 鏈的 3' 末端羥基發(fā)生。 DNA 聚合酶需要一小段 DNA 與互補(bǔ)序列退火。 該 DNA 序列或 寡核苷酸 稱為引物，因?yàn)樾枰鼇?lái)引發(fā)合成。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或 PCR 是由 Kary B. Mullis 于 1983 年發(fā)現(xiàn)、構(gòu)思或發(fā)明的。據(jù)他說(shuō)，他在月光下的加利福尼亞北部開(kāi)車時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)了這種反應(yīng)。 此外，正如他所指出的，該反應(yīng)允許在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)從單個(gè) DNA 分子生成多達(dá) 1000 億個(gè)類似的 DNA 分子。 該反應(yīng)可以在試管中進(jìn)行，但也需要一些試劑和熱源。 PCR 反應(yīng)的引入使分子生物學(xué)家的生活變得更加輕松，使他們能夠生產(chǎn)盡可能多的 DNA。 該技術(shù)以驚人的速度傳播到整個(gè)生物科學(xué)領(lǐng)域。 然而，由于反應(yīng)涉及熱循環(huán)，最終改進(jìn)的 PCR 技術(shù)中最重要的部分是使用熱穩(wěn)定的 DNA 聚合酶。 最初從提取的聚合酶棲熱菌中水生動(dòng)物 現(xiàn)在幾乎用于所有 PCR 反應(yīng)。 聚合酶鏈反應(yīng)已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域的終極改變游戲規(guī)則的技術(shù)。

聚合酶鏈反應(yīng)的特點(diǎn)

* 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR) 選擇性地?cái)U(kuò)增目標(biāo) DNA 分子。

* 它允許在熱變性、引物退火和引物延伸的重復(fù)循環(huán)中延伸短的單鏈合成寡核苷酸、引物。

* PCR 是一個(gè)循環(huán)過(guò)程，其中一系列步驟一遍又一遍地重復(fù)。

* 雙鏈 DNA 片段通過(guò)稱為變性的溫和加熱分離成單鏈。

* 將短的合成寡核苷酸引物與四種脫氧核糖核苷酸三磷酸 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 和 DNA 聚合酶（現(xiàn)在通常是 Taq DNA 聚合酶）一起添加到反應(yīng)混合物中。

輝駿生物PCR實(shí)驗(yàn)服務(wù)流程

1．引物設(shè)計(jì)與合成；

2．基因模板制備：RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，或DNA提??；

3．qPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增情況；

4．qPCR正式實(shí)驗(yàn)：全部樣本做qPCR，每個(gè)樣本設(shè)置三復(fù)孔；確定樣本擴(kuò)增產(chǎn)物單一，內(nèi)參基因CT值正常；

5.  數(shù)據(jù)分析和出具報(bào)告：按照客戶要求計(jì)算樣本間的目的基因表達(dá)差異，并作柱形圖。

參考

1. Eom SH, Wang J, Steitz TA.; Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site. Nature. 1996 Jul 18; 382(6588):278-81.

2. Faloona, F., Weiss, S., Ferre, F., and Mullis, K. 1990. Direct detection of HIV sequences in blood high-gain polymerase chain reaction [abstract]. In: 6th International Conference on AIDS, University of California, San Francisco: San Francisco (CA). Abstract 1019.

3. Gelfand, D.H. and White, T.J. 1990. Thermostable DNA polymerases. In: PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M.A., Gelfand, D.H., Sninsky, J.J., and White, T.J., eds. San Diego: Academic Press. 129–141.

4. Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R., and Gelfand, D.H. 1991. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5′→3′ exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276–7280.

5. Innis, M.A., Myambo, K.B., Gelfand, D.H., and Brow, M.A. 1988. DNA sequencing with Thermusaquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified  DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:9436–9440.

6. Mullis K.  In Methods In Enzymology, Vol.155, 335, 1987.

7. Kary B. Mullis; The Unusual Origin of the Polymerase Chain Reaction. SCIENTIFIC AMERICAN April 1990. 56-65.