互作實驗蛋白實驗分子細(xì)胞實驗

免疫共沉淀Co-IP實驗操作問題答疑

Q1：免疫共沉淀Co-IP如果沒有與目標(biāo)蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)怎么辦？或者，交互蛋白的信號太弱怎么辦？

A1：可能是由于以下3種原因?qū)е拢?

1. 裂解緩沖液中的去污劑濃度可能過高或過強(qiáng)。

降低洗滌劑的濃度，或?qū)⑵涓臑闇睾偷?。通常，洗滌劑的?qiáng)度順序應(yīng)為：

SDS>Trition>NP40>Digitonin>CHAPS

2. 靶蛋白在細(xì)胞中亞定位的影響。

改變裂解緩沖液的配方，使蛋白質(zhì)釋放。

3. 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用太弱或不穩(wěn)定。

將抗體更改為更親和的抗體以捕獲更多的靶蛋白。或者，應(yīng)用表達(dá)系統(tǒng)來提高目標(biāo)蛋白的純度和濃度。其他，改變樣品來源或優(yōu)化樣品處理，使樣品具有更多的目標(biāo)蛋白或相互作用蛋白。

Q2：假陽性太強(qiáng)或檢測到的非特異性結(jié)合蛋白太多該如何操作？

A2：可能是以下2種原因：

1. 抗體濃度太高。

降低抗體濃度

2. 抗體特異性不夠好。

將抗體更換為更好的抗體。如果非特異性結(jié)合仍然存在，將 NaCl 的濃度增加到低于 1M。

免疫共沉淀CoIP實驗技術(shù)原理

細(xì)胞裂解后，孵育結(jié)合了抗體的珠子，誘餌蛋白通過其抗體結(jié)合到Beads上，同時誘餌蛋白的互作蛋白，也一起“共沉淀”到Beads上。洗滌掉未結(jié)合的蛋白后，再用洗脫液將互作蛋白復(fù)合物從Beads洗脫下來，便得到免疫共沉淀CoIP產(chǎn)物。CoIP產(chǎn)物既可用Western Blot檢測已知蛋白，也可用質(zhì)譜鑒定未知蛋白。

當(dāng)沒有合適的誘餌蛋白抗體時，可以通過表達(dá)融合了Flag標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用Flag標(biāo)簽做免疫沉淀。即細(xì)胞過表達(dá)Flag-Bait，經(jīng)裂解后與anti-Flag珠子孵育，誘餌融合蛋白與Beads結(jié)合，其互作蛋白“共沉淀”到Beads上，再經(jīng)洗滌、洗脫后用WB或質(zhì)譜檢測。

輝駿生物提供的Co-IP免疫共沉淀服務(wù)分為以下兩種：

1. Co-IP WB，用于檢測某樣本中的誘餌蛋白和待測蛋白是否存在相互作用；

2. Co-IP MS，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白與哪些蛋白具有相互作用。

Co-IP（免疫共沉淀）檢測服務(wù)
服務(wù)項目	服務(wù)內(nèi)容	結(jié)果交付	實驗周期	客戶提供	價格
Co-IP WB	Western blot檢測樣本（input）中的誘餌蛋白和待測蛋白	Western blot檢測圖	4-5周	1、實驗樣本 2、誘餌蛋白的IP級抗體 3、待測蛋白抗體 4、實驗信息表（樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白和待測蛋白序列）	點擊詢價
	Co-IP調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白（2組：實驗組、對照組）	CoIP實驗報告
	Western blot檢測Co-IP產(chǎn)物中的誘餌蛋白和待測蛋白	Western blot檢測圖
Co-IP MS	Western blot檢測樣本（input）中的誘餌蛋白	Western blot檢測圖	7-8周	1、實驗樣本 2、誘餌蛋白的IP級抗體 3、實驗信息表（樣本信息、抗體信息、誘餌蛋白序列）	點擊詢價
	Co-IP調(diào)取誘餌蛋白及其互作蛋白（2組：實驗組、對照組）	CoIP實驗服務(wù)報告
	Western blot檢測Co-IP產(chǎn)物中的誘餌蛋白	Western blot檢測圖
	LC-MS/MS定性檢測Co-IP產(chǎn)物的蛋白、篩選實驗組獨(dú)有蛋白（潛在互作蛋白）	質(zhì)譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報告
	針對互作蛋白做生物信息學(xué)分析（GO、KEGG pathway、String）	生物信息學(xué)分析結(jié)果和報告	1周