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中文標(biāo)題：CircVPRBP通過抑制RACK1蛋白O-GlcNAc修飾和穩(wěn)定性來阻礙宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

發(fā)表期刊：Oncogene

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：8.756

發(fā)表時間：2023年1月

合作單位：中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院

運用技術(shù)：RNA免疫共沉淀（RIP）、LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是宮頸癌（CCa）患者最惡性的臨床特征之一，但目前尚不清楚如何有效防止淋巴管生成和抑制宮頸癌細胞的侵襲性。circRNA比線性mRNA更穩(wěn)定，可能參與許多癌癥的進展。先前的研究發(fā)現(xiàn)，circVPRBP (hsa_circ_0065898)是在CCa中水平下調(diào)。因此本研究探索了circVPRBP在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)功能和臨床意義。

● 研究結(jié)果

1. CircVPRBP在宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中表達下調(diào)

Sanger測序首先確定了circVPRBP的剪接位點（圖1A）。RT-qPCR再次確認(rèn)了circVPRB在宮頸癌細胞系中的表達下調(diào)，并且在原發(fā)性腫瘤衍生細胞系HeLa、HeLa229、SiHa、C33A中的含量比轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)衍生細胞系HT-3和MS751的更高（圖1B）。同樣的，circVPRBP在宮頸癌患者樣本中的水平顯著低于非腫瘤組織，且在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移樣本中的表達逐漸消失（圖1C）。原位雜交、LYVE-1染色、Kaplan–Meier生存曲線和log-rank檢驗分析等實驗表明， circVPRBP表達缺失在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)性腫瘤中更常見（圖1D），當(dāng)circVPRBP水平較低時，宮頸癌瘤內(nèi)和瘤周區(qū)域的淋巴管數(shù)量顯著增加（圖1E、F），且患者的總生存期（OS）和無病生存期（DFS）較短（圖1G，H）。表明circVPRBP的缺失有助于宮頸癌淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移，它的水平對宮頸癌患者有預(yù)后價值。

  圖1

2. CircVPRBP可抑制宮頸癌的體外細胞侵襲和體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移                                                       

研究者構(gòu)建了circVPRBP過表達和沉默的宮頸癌細胞系（圖2A-D），并進行了體外和體內(nèi)功能實驗。Transwell結(jié)果表明，circVPRBP過表達消除了宮頸癌細胞的侵襲性，沉默促進了侵襲能力（圖2E，F(xiàn)）。在裸鼠體內(nèi)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型中（圖2G），circVPRBP過表達顯著抑制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)體積較小，沉默可促進宮頸癌細胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，淋巴結(jié)體積較大（圖2H,I）。角蛋白免疫組化染色也表明，circVPRBP過表達顯著抑制了宮頸癌細胞的淋巴轉(zhuǎn)移能力，沉默增加了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（圖2J，K）。這些結(jié)果表明circVPRBP可以抑制體內(nèi)宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖2

3. CircVPRBP抑制體內(nèi)和體外的淋巴管生成

淋巴管生成在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中具有重要作用，因此靶向淋巴管生成的信號通路可能是一種有效的治療策略。為了驗證circVPRB是否影響淋巴管生成，使用淋巴標(biāo)記物L(fēng)YVE-1的抗體進行免疫組化（IHC）分析，發(fā)現(xiàn)在circVPRBP過表達的小鼠體內(nèi)，LYVE-1陽性血管顯著減少，而在circVPRB沉默的小鼠體內(nèi)顯著升高（圖3A，B），表明circVPRBP在體內(nèi)抑制淋巴管生成。血管形成實驗進一步表明，circVPRBP過表達顯著抑制了人淋巴內(nèi)皮細胞（HLEC）的血管形成，而circVPRB缺失顯著增加了HLEC的血管形成能力（圖3C，D）。

圖3

致瘤性是與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)的主要因素，因此研究人員分析了circVPRBP在宮頸癌中的致瘤作用。CCK-8、克隆形成和EdU增殖實驗發(fā)現(xiàn)，circVPRBP過表達降低了宮頸癌細胞的增殖和克隆形成，而circVPRBP沉默有相反作用（圖4A-H）。之后，通過構(gòu)建皮下異種移植動物模型以評估circVPRBP在體內(nèi)的致瘤能力，發(fā)現(xiàn)circVPRBP過表達降低了宮頸癌的腫瘤生長（圖4I），且腫瘤重量和大小均低于對照組（圖4J-O）。這些結(jié)果表明circVPRBP可以抑制癌癥淋巴管的生成。

圖4

4. CircVPRBP與RACK1相互作用抑制RACK1蛋白表達

接著，研究者以circVPRBP作為誘餌進行了RNA pull down和質(zhì)譜（MS）檢測，找到了circVPRBP的潛在結(jié)合蛋白RACK1（圖5A，B），RNA免疫沉淀（RIP）實驗確定了兩者的內(nèi)源性結(jié)合（圖5C，D），熒光共定位實驗也發(fā)現(xiàn)circVPRBP和RACK1蛋白共定位于細胞質(zhì)中（圖5E）。circVPRBP截短片段的RNA pull down實驗進一步確定了其122-182nt片段與RACK1蛋白結(jié)合（圖5F、G）。過表達circVPRBP幾乎不影響RACK1的mRNA表達，但顯著降低了RACK1的蛋白水平(圖5F, G)。已有研究表明，宮頸癌細胞中的RACK1通過增強Galectin-1誘導(dǎo)的下游FAK和AKT信號通路，促進宮頸癌癥淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達circVPRBP也抑制了pAKT、pFAK和Galectin-1的表達（圖5I–K）。總之，這些結(jié)果表明circVPRBP可以結(jié)合RACK1并抑制RACK1蛋白的表達。

圖5

5. CircVPRBP可阻礙RACK1-S122位點的O-GlcNAc修飾來使其降解

為了探討circVPRBP是否通過蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解誘導(dǎo)RACK1蛋白下調(diào)，研究者首先使用蛋白酶體抑制劑MG132處理宮頸癌細胞，當(dāng)?shù)鞍?/span>降解被MG132處理阻斷時，過表達或干擾circVPRBP不改變RACK1蛋白水平（圖6A，B）。用CHX蛋白合成抑制劑處理后，過表達circVPRBP加速了RACK1蛋白的降解，沉默有相反效果（圖6C），此外，circVPRBP過表達導(dǎo)致RACK1蛋白的多泛素化顯著增加（圖6D）。先前的文獻表明，O-GlcNAc糖基化修飾影響RACK1的穩(wěn)定性，那么circVPRBP是否影響RACK1的O-GlcNAc修飾呢？免疫共沉淀（Co-IP）發(fā)現(xiàn)circVPRBP過表達顯著降低了RACK1的O-GlcNAc（RL2）水平，并降低了O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)與RACK1之間的結(jié)合（圖6E），沉默circVPRBP有相反結(jié)果（圖6F）。RACK1的S122-O-GlcNAc位點突變使circVPRBP不再促進RACK1降解（圖6G）。RNA pull down分析發(fā)現(xiàn)，缺失WD3區(qū)的RACK1突變體（ΔWD3-RACK1-flag）不能與circVPRBP結(jié)合，表明WD3區(qū)域包含circVPRBC結(jié)合位點。CoIP實驗也表明，ΔWD3-RACK1不能與OGT結(jié)合，說明WD3區(qū)域也包含OGT結(jié)合位點（圖6H）。這些結(jié)果表明circVPRBP通過阻斷RACK1的S122位點O-GlcNAc糖基化介導(dǎo)RACK1降解。

圖6

6. CircVPRBP以RACK1-依賴的方式抑制宮頸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

接下來，通過挽救試驗分析了circVPRBP是否以RACK1依賴的方式抑制細胞的淋巴轉(zhuǎn)移。在宮頸癌細胞中使用Tet-on誘導(dǎo)系統(tǒng)來誘導(dǎo)RACK1表達，同時過表達circVPRBP或空載體（圖7A），也構(gòu)建了相應(yīng)的異種移植小鼠腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制作用（圖7B），circVPRBP過表達組的腘窩淋巴結(jié)體積明顯小于對照組，并且Dox誘導(dǎo)的RACK1組的淋巴結(jié)體積大于空載體和circVPRBP過表達組（圖7C）。角蛋白免疫染色實驗表明，circVPRBP過表達顯著抑制了宮頸癌細胞向腘窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的能力，Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了這一趨勢（圖7D、E）。此外，Dox誘導(dǎo)的RACK1在體內(nèi)和體外顯著逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對淋巴管生成的抑制作用（圖7F–I）。這些結(jié)果說明circVPRBP通過參與RACK1降解來抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管生成。

圖7

此外，研究者還構(gòu)建了體內(nèi)皮下異種移植模型來確定circVPRB對宮頸癌細胞的增殖抑制是否也通過RACK1起作用。結(jié)果顯示，Dox誘導(dǎo)的RACK1逆轉(zhuǎn)了circVPRB過表達對腫瘤生長的抑制（圖8A-C）。體外細胞實驗也發(fā)現(xiàn)Dox誘導(dǎo)的RACK1消除了circVPRBP對細胞增殖和侵襲的抑制（圖8D-I），逆轉(zhuǎn)了circVPRBP對Galectin-1、pAKT和pFAK表達水平的抑制（圖8J）。在宮頸癌患者中，低circVPRBP表達和高RACK1表達存在負(fù)相關(guān)性（圖8K）。這些研究結(jié)果表明，circVPRBP通過促進RACK1的降解來抑制宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

圖8

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