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中文標(biāo)題：家蠶絲素基因啟動子結(jié)合蛋白的新進展研究

發(fā)表期刊：Scientific Reports

影響因子：4.379

發(fā)表時間：2021年8月

合作單位：西南大學(xué)

運用技術(shù)：DNA pull down MS（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

家蠶的絲腺是一種特殊的器官，它可以有效地合成絲素蛋白和絲膠蛋白，并紡出繭子。絲腺又分前絲腺、中絲腺和后絲腺，后絲腺是唯一合成絲素蛋白的部分。絲素蛋白是一種分泌性復(fù)合蛋白，約占絲綢纖維的75%，由絲素蛋白重鏈(FibH)、絲素蛋白輕鏈(Fibl)和 P25糖蛋白組成。那么，哪些因素直接參與了絲素蛋白合成調(diào)控呢？本研究聚焦調(diào)控絲素蛋白（fibH、fibL、P25)編碼基因的啟動子結(jié)合蛋白，利用DNA pull down MS技術(shù)篩選了幼蟲第四次蛻皮期 (M4)和5齡幼蟲第5天(L5D5)這兩個具有代表性的發(fā)育階段，從后絲腺中鑒定出大量fih、fibL和P25啟動子的結(jié)合蛋白，并分析了M4和L5D5之間存在共同和獨特結(jié)合蛋白，及它們的功能特征和相互作用關(guān)系，為了解絲蛋白基因的相關(guān)調(diào)節(jié)因子提供了新的見解。

● 研究結(jié)果

1. DNA pull down MS技術(shù)篩選目標(biāo)啟動子的相互作用蛋白

為了鑒定家蠶M4和L5D5后絲腺（圖1a）中絲素基因啟動子的結(jié)合蛋白，研究者首先查找了fibH、fibL和P25的潛在啟動子序列，雙熒光素酶實驗確定了這些啟動子序列的活性顯著高于陰性對照（圖1b，c）。之后，他們采用DNA pull down技術(shù)篩選這些啟動子的結(jié)合蛋白。生物素化的fibH、fibL和P25 DNA探針分別與樣本孵育后，與未生物素化探針孵育的對照組相比，M4或L5D5后絲腺的多個蛋白質(zhì)有明顯富集。

  圖1

2. M4和L5D5發(fā)育階段后絲腺中絲素基因啟動子結(jié)合蛋白的比較                                                                 

對DNA pull down蛋白產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測（LC-MS/MS）結(jié)果顯示，M4和L5D5 PSGs中分別篩選到的fih啟動子結(jié)合蛋白分別為198和330個, fibL啟動子結(jié)合蛋白分別為292和305個, P25啟動子結(jié)合蛋白分別為247和460個。值得注意的是， L5D5樣本鑒定出的啟動子結(jié)合蛋白比從M4的豐富很多，意味著L5D5階段招募了更多的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)絲素基因的表達(dá)，是有效合成的關(guān)鍵時期。進一步的分析顯示，M4和L5D5發(fā)育階段中常見的fibH、fibL和P25啟動子結(jié)合蛋白分別有109、156和158個（圖2a）。對這些蛋白的KEGG分析發(fā)現(xiàn)它們主要參與了代謝途徑（尤其是次級代謝產(chǎn)物的生物合成和不同環(huán)境中的微生物代謝）和遺傳信息處理(尤其是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的核糖體、蛋白酶體和蛋白質(zhì)處理)（圖2b）。圖3繪制了不同發(fā)育階段（圖3a為M4，圖3b為L5D5）3種啟動子的結(jié)合蛋白在各主要KEGG pathway條目中注釋到的數(shù)目差別。

圖2

圖3

3. 三種絲素蛋白基因啟動子的共有結(jié)合蛋白分析

接著，研究者篩選了三個絲素基因啟動子的共有結(jié)合蛋白，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)結(jié)合蛋白是fibH、fibL和P25基因啟動子共有的（圖4a）。KEGG pathway分析顯示，這些蛋白注釋到6個主要的KEGG pathway，其中一些結(jié)合蛋白在M4和L5D4的PSG中都被發(fā)現(xiàn)（圖4b）。兩個發(fā)育階段鑒定的啟動子結(jié)合蛋白更多的注釋到人類神經(jīng)退行性疾病通路，如阿爾茨海默病和帕金森病等，其次是參與核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路（圖5）。之后，研究者又使用STRING工具分析了這些結(jié)合蛋白間的作用關(guān)系，并繪制了網(wǎng)絡(luò)圖。

圖4

圖5

4. 絲素蛋白基因啟動子結(jié)合蛋白中的轉(zhuǎn)錄因子

轉(zhuǎn)錄因子對于絲素基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的調(diào)控是不可或缺的。本研究鑒定到共31個潛在的轉(zhuǎn)錄因子，分布在18條染色體上，這些轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)絲素基因表達(dá)方面的功能大多未見報道。值得注意的是，在M4和L5D5兩個階段都能與所有絲素基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子共5個，只在M4或L5D5階段可以與所有絲素基因啟動子結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子分別為11個和10個，有5個轉(zhuǎn)錄因子只在M4階段被富集，有9個轉(zhuǎn)錄因子只在L5D5階段被富集。這些結(jié)果可能反映了轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)三種絲素基因表達(dá)的異同，值得進一步研究。

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