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中文標(biāo)題：METTL3介導(dǎo)的LncRNA EN_42575 m6A修飾減輕了CPB2毒素誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞損傷

發(fā)表期刊：International Journal of Molecular Sciences

中科院分區(qū)：2區(qū)

影響因子：6.208

發(fā)表時間：2023年3月

合作單位：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)

運用技術(shù)：RNA pull down MS（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

m6A修飾是真核生物中最豐富的RNA修飾，受多種酶類的調(diào)控，其中METTL3、METTL14和WTAP可形成復(fù)合體，是m6A甲基化酶的核心組分。C型產(chǎn)氣莢膜梭菌侵襲性強，可感染家畜和人類，引起壞死性腸炎，產(chǎn)氣莢膜梭菌β2 (CPB2)毒素是該菌的主要毒力因子。研究者之前已構(gòu)建了C型產(chǎn)氣莢膜菌仔豬腹瀉體外細(xì)胞模型，并RNA免疫沉淀測序(MeRIP-seq)實驗發(fā)現(xiàn)lncRNA EN_42575的甲基化水平和表達(dá)水平因CPB2毒素處理而顯著降低。本項目進(jìn)一步闡述了lncRNA EN_42575的m6A修飾在該過程中的作用，為探討仔豬感染性腹瀉的表觀遺傳學(xué)觀點提供了理論依據(jù)。

● 研究結(jié)果

1. LncRNA EN_42575的表達(dá)模式分析

為了評估CPB2毒素處理對lncRNA EN_42575表達(dá)的影響，研究者每12 h檢測CPB2毒素培養(yǎng)的豬小腸上皮細(xì)胞（IPEC-J2）中的LncRNA EN_42575表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CPB2毒素處理可以顯著降低lncRNA EN_42575的表達(dá)，處理24h達(dá)到最低值（圖1A）。細(xì)胞核/質(zhì)分離和RNA-FISH分析發(fā)現(xiàn)，lncRNA EN_42575定位于細(xì)胞質(zhì)中（圖1B,C）。這些結(jié)果表明lncRNA EN_42575在產(chǎn)氣莢膜梭菌C型誘導(dǎo)的豬腹瀉中起到了一定作用。

  圖1

2. LncRNA EN_42575減輕CPB2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，促進(jìn)細(xì)胞增殖                                                                              

接著，研究者分別構(gòu)建了過表達(dá)和干擾lncRNA EN_42575的IPEC-J2細(xì)胞株（圖2A），用以分析lncRNA EN_42575在CPB2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性中的作用。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測用于細(xì)胞損傷程度，結(jié)果顯示CPB2處理引起LDH活性顯著增加，而lncRNA EN_42575的表達(dá)水平與LDH活性成反相關(guān)，表明lncRNA EN _42575可以抑制細(xì)胞毒性（圖2B）。CCK-8和EDU檢測表明，CPB2處理顯著降低了IPEC-J2細(xì)胞的活力和增殖能力，而lncRNA EN_42575過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了這一結(jié)果，lncRNA EN_42575干擾進(jìn)一步抑制了細(xì)胞活力和增殖能力（圖2C-E）。

圖2

3. LncRNA EN_42575抑制CPB2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷

在細(xì)胞凋亡反應(yīng)中，線粒體膜電位(ΔΨm)會降低，因此研究者用JC-1線粒體膜電位探針來檢測LncRNA EN_42575對CPB2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。CPB2毒素處理后，JC-1熒光從紅色變?yōu)榫G色，表明ΔΨm降低，凋亡增加。lncRNA EN_42575過表達(dá)導(dǎo)致綠色熒光減少，干擾后綠色熒光進(jìn)一步增加（圖3A）。lncRNA EN_42575過表達(dá)顯著抑制了凋亡調(diào)節(jié)因子Bax的表達(dá)，促進(jìn)了Bcl-2的表達(dá)，而lncRNA EN _42575干擾有相反趨勢（圖3B，C）。之后，研究者用熒光探針DCFHDA檢測細(xì)胞中的活性氧（ROS），CPB2處理顯著增加了綠色熒光，表明ROS水平升高，LncRNA EN_42575過表達(dá)降低了ROS水平，而干擾促進(jìn)了ROS的升高（圖3D）。這些結(jié)果說明lncRNA EN_42575可以抑制IPEC-J2細(xì)胞凋亡并減輕CPB2毒素誘導(dǎo)的氧化損傷。

圖3

4. LncRNA EN_42575是METTL3的靶標(biāo)

研究者使用Integrative Genomics Viewer軟件對以往的MeRIP-seq項目數(shù)據(jù)進(jìn)行了可視化分析，發(fā)現(xiàn)CPB2毒素處理導(dǎo)致兩個高富集的特異性m6A峰消失了（圖4A）。MeRIP-qPCR實驗也證實CPB2處理顯著降低了lncRNA EN_42575的m6A甲基化水平（圖4B）。為了研究甲基化相關(guān)酶對lncRNA EN_42575的調(diào)控，分別過表達(dá)和敲低了METTL3（圖4C），發(fā)現(xiàn)其水平與lncRNA EN_42575成正相關(guān)（圖4D）。為了確定lncRNA EN_42575的m6A修飾對METTL3介導(dǎo)的基因調(diào)控的重要性，研究者構(gòu)建了lncRNA EN_42575野生型和突變型(A到T)載體（圖4E），并進(jìn)行了雙熒光素酶實驗。結(jié)果顯示，野生型METTL3顯著增加了野生型lncRNA EN_42575的熒光素酶活性，不能增加突變型lncRNA EN_42575的熒光素酶活性；突變型METTL3與對照相比沒有變化（圖4F）。此外，在用放線菌素D阻斷細(xì)胞RNA合成后，抑制METTL3的表達(dá)顯著降低了lncRNA EN_42575的半衰期（t1/2）（圖4G）。這些結(jié)果表明，METTL3通過m6A甲基化調(diào)控lncRNA EN_42575的表達(dá)。

圖4

5. lncRNA EN_42575靶基因的功能分析

為了確定lncRNA EN_42575在CPB2誘導(dǎo)的IPEC-J2細(xì)胞中的功能。研究者采用RNA pull down MS技術(shù)來尋找能夠與lncRNA EN_42575結(jié)合的蛋白質(zhì)。對質(zhì)譜（LC-MS/MS）鑒定到的70個潛在結(jié)合蛋白的GO功能和KEGG通路分析顯示，它們參與了凋亡、沙門氏菌感染、癌癥通路和冠狀病毒?。ㄐ鹿诜窝祝┑认嚓P(guān)通路（圖5B）。

圖5

● 結(jié)論

本項目在前期MeRIP-seq實驗的基礎(chǔ)上，在仔豬感染性腹瀉細(xì)胞模型中，進(jìn)一步闡明了METTL3酶通過m6A甲基化調(diào)控lncRNA EN_42575的表達(dá)，進(jìn)而抑制了CPB2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

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