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中文標(biāo)題：在mir-181a/PPFIA1信號(hào)通路中發(fā)現(xiàn)致癌的PARP1，或成為BCR-ABL的靶點(diǎn)并有著潛在的治療作用

發(fā)表期刊：Mol Ther Nucleic Acids

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：10.183

發(fā)表時(shí)間：2019年

合作單位：暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院

運(yùn)用技術(shù)：SILAC、免疫共沉淀（Co-IP）（由輝駿生物提供技術(shù)支持,點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

慢性粒細(xì)胞白血病(CML)是一種克隆性骨髓增生性疾病，每10萬人中約有1-2人，占成人白血病總數(shù)的15%。MIR-181a在白血病中表達(dá)下調(diào)，并影響其進(jìn)展、耐藥性和預(yù)后，然而，其靶點(diǎn)在白血病，特別是慢性粒細(xì)胞白血病(CML)中的確切作用機(jī)制尚不清楚。

● 研究結(jié)果

1. MiR-181a在CML中的直接靶基因是PPFIA1

qPCR首先檢測(cè)了miR-181a在健康血細(xì)胞、人類CML樣本和CML細(xì)胞系中的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-181a在人CML樣本和CML細(xì)胞系中的水平較低(圖1A)，表明miR-181a的下調(diào)可能在白血病發(fā)生有關(guān)。因此，研究者采用SILAC蛋白組學(xué)和基因芯片技術(shù)聯(lián)合分析了miR-181a過表達(dá)對(duì)CML細(xì)胞株K562的影響(圖1C)，結(jié)合miRNA靶基因預(yù)測(cè)，確定了15個(gè)候選的miR-181a靶基因。其中，PPFIA1被選作進(jìn)一步分析(圖1D-E)。qRT-PCR和WB檢測(cè)分別確定了PPFIA1基因和蛋白水平在miR-181a過表達(dá)的K562細(xì)胞中下調(diào)(圖1F)。接下來，研究者采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來驗(yàn)證PPFIA1是否為miR-181a的靶基因。在293T細(xì)胞中，miR-181a轉(zhuǎn)染可顯著降低PPFIA1-3'UTR的熒光素酶活性，但對(duì)3'UTR的突變序列沒有作用(圖1G)。這些結(jié)果表明，PPFIA1是K562細(xì)胞中miR-181a的直接靶點(diǎn)之一。

圖1

2. PPFIA1或miR-181a在慢性粒細(xì)胞白血病惡性進(jìn)展中的作用

接下來，研究者檢測(cè)了PPFIA1在疾病和對(duì)照樣本中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)PPFIA1在白血病細(xì)胞或組織樣本中表達(dá)較高(圖2B)。MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MiR-181a過表達(dá)和PPFIA1干擾均以濃度依賴的方式增加了K562細(xì)胞對(duì)IM處理的敏感性(圖2A)；Transwell分析和克隆形成實(shí)驗(yàn)也表明，miR-181a過表達(dá)或PPFIA1干擾顯著降低了CML細(xì)胞的侵襲能力(圖2B)和細(xì)胞集落形成能力(圖2C)。當(dāng)在K562細(xì)胞中過表達(dá)PPFIA1后，MTT、Transwell細(xì)胞侵襲和克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PPFIA1顯著抑制了IM對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用，細(xì)胞活力增加(圖2D)，增強(qiáng)了細(xì)胞侵襲力(圖2E)，增加了細(xì)胞集落數(shù)(圖2E)。這些結(jié)果表明，PPFIA1和miR-181a的表達(dá)水平與K562細(xì)胞的惡性表型相關(guān)。

圖2

3. PPFIA1 siRNA對(duì)CML異種移植小鼠模型的抑制作用

為了探討PPFIA1-siRNA的治療潛力，研究者將106個(gè)熒光素酶標(biāo)記的K562細(xì)胞注射到NSG小鼠體內(nèi)，并通過生物成像監(jiān)測(cè)siRNA的治療效果。在注射k562熒光素酶細(xì)胞5天后，NSG小鼠分別用PPFIA1-siRNA或NC siRNA對(duì)照隔天處理共7次。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PPFIA1 siRNA顯著抑制了K562-熒光素酶細(xì)胞的生長(zhǎng)(圖3A)；接受NC-siRNA治療的小鼠的相對(duì)熒光素酶值從接種腫瘤時(shí)的1.58e+6上升到8.01e+8（在第21天），而接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠的則從1.56e+6上升到1.35e+8(圖3B)。這些結(jié)果表明，PPFIA1-siRNA可以抑制K562-熒光素酶細(xì)胞在體內(nèi)的生長(zhǎng)。研究者繼續(xù)分析了體重這一動(dòng)物模型癌癥惡病質(zhì)的重要指標(biāo)，接受NC-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g下降到26.4g，而接受PPFIA1-siRNA治療的小鼠的平均體重從27.9g增加到28.4g(圖3C)。接受PPFIA1 siRNA治療的小鼠比對(duì)照組的小鼠存活時(shí)間更長(zhǎng)(圖3D)。這些結(jié)果表明，PPFIA1 siRNA可能是治療CML的一種有前途的藥物。

圖3

4. 通過磷酸陣列分析檢測(cè)到PPFIA1-siRNA降低KIT磷酸化水平

為了探索PPFIA1增強(qiáng)CML細(xì)胞侵襲性和克隆性的機(jī)制，研究者進(jìn)行了磷酸陣列檢測(cè)，通過計(jì)算實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組(PPFIA1-siRNA/NC和miR-181a mimic/NC)在248個(gè)特異磷酸化位點(diǎn)上的磷酸化比率尋找差異位點(diǎn)(圖4A)。在miR-181a模擬轉(zhuǎn)染組中，23個(gè)蛋白位點(diǎn)的磷酸化水平降低，其中7個(gè)位點(diǎn)比NC轉(zhuǎn)染組降低了30%(圖4B)。PPFIA1 siRNA轉(zhuǎn)染降低了60個(gè)蛋白位點(diǎn)的磷酸化，其中8個(gè)位點(diǎn)降低了50%(圖4C)。研究者最終確定了受miR-181a mimic和PPFIA1-siRNA處理影響的三個(gè)磷酸化靶點(diǎn)，KIT-Tyr721、MAPK-Tyr182和VEGFR2-Tyr951(圖4D)。已知KIT與CML發(fā)病機(jī)制有關(guān)，因此他們推測(cè)miR-181a的靶點(diǎn)PPFIA1可能通過激活K562細(xì)胞的KIT信號(hào)通路促進(jìn)惡性表型。在過表達(dá)PPFIA1的K562細(xì)胞株中，KIT-Tyr721的磷酸化水平顯著增加(圖4E)，而PPFIA1- siRNA則有相反效果(圖4F)。這些數(shù)據(jù)表明，PPFIA1可能通過激活CML中的KIT通路而發(fā)揮致癌作用。

圖4

5. PPFIA1和BCR/ABL的重要下游分子PARP1

為了探討PPFIA1和KIT之間的關(guān)系，研究者在K562細(xì)胞中過表達(dá)FLAG-PPFIA1，并分別進(jìn)行了BCR和FLAG抗體的免疫共沉淀(Co-IP)，對(duì)IP產(chǎn)物的質(zhì)譜分析結(jié)果顯示，PARP1蛋白同時(shí)與FLAG-PPFIA1和BCR相互作用(圖5A)。分子對(duì)接分析表明，PARP1催化結(jié)構(gòu)域可以與PPFIA1 (PDB: 3TAC)和ABL1 結(jié)構(gòu)域(PDB: 5HU9)結(jié)合(圖5B，C)，ABL1的F-actin結(jié)構(gòu)域可以與PARP1的催化結(jié)構(gòu)域?qū)?圖5D)，而SH2結(jié)構(gòu)域不能與PARP1的催化結(jié)構(gòu)域?qū)印Ｓ捎跓o法獲得BCR/ABL融合蛋白，研究者純化了ABL的每個(gè)結(jié)構(gòu)域，并進(jìn)行了表面等離子體共振成像（SPRi）分析，結(jié)果證實(shí)ABL1的F-actin結(jié)構(gòu)域可以與PARP1結(jié)合，與分子對(duì)接分析結(jié)果一致(圖5E)。此外，Co-IP WB實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了與PPFIA1和ABL1相互作用的下游分子PARP1（圖5F-5I）?；谶@些結(jié)果，研究者推測(cè)PARP1介導(dǎo)了PPFIA1和KIT之間的關(guān)系。

圖5

6. PARP1通過激活NF-kB-P65轉(zhuǎn)錄促進(jìn)KIT表達(dá)

已知PARP1是NF-kB轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)復(fù)合物的關(guān)鍵成分。因此，研究者推測(cè)PPFIA1通過PARP1、P65和KIT通路參與白血病的生長(zhǎng)。與預(yù)想一致，在K562細(xì)胞中過表達(dá)PARP1可導(dǎo)致P65表達(dá)水平上調(diào)，而使用奧拉帕尼(PARP1抑制劑[PARPi])導(dǎo)致P65下調(diào)(圖6A-6C)。此外，過表達(dá)P65還導(dǎo)致KIT的mRNA和蛋白上調(diào)，而P65- siRNA則導(dǎo)致KIT水平下調(diào)(圖6D-6F)。這些數(shù)據(jù)表明，PPFIA1通過與PARP1相互作用參與了KIT水平的調(diào)控，而PARP1調(diào)節(jié)NF-kB和P65的轉(zhuǎn)錄活性。PPFIA1/PARP1/NF-kB-P65/KIT可能在CML中構(gòu)成了一個(gè)調(diào)控軸。那么，靶向PARP1是否可以治療CML呢？研究者構(gòu)建了一個(gè)Baf3-P210驅(qū)動(dòng)的過表達(dá)PPFIA1的白血病細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)奧拉帕尼顯著抑制了PPFIA1過表達(dá)細(xì)胞的克隆形成能力(圖6G)。接著，他們將該細(xì)胞移植到用3Gy X射線輻射的BALB/c小鼠中，移植小鼠連續(xù)7天單獨(dú)服用奧拉帕利布或生理鹽水對(duì)照。接受奧拉帕利治療的動(dòng)物比空載組的動(dòng)物存活時(shí)間更長(zhǎng)(圖6H)。這些結(jié)果表明，PARP是治療慢性粒細(xì)胞白血病的一種有前途的方法。

圖6

● 結(jié)論

miR-181a在白血病特別是慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）中表達(dá)下調(diào)，并影響疾病發(fā)展、耐藥性和預(yù)后。本研究通過基因芯片和SILAC蛋白組學(xué)等方法聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)PPFIA1是miR-181a的直接靶基因，并利用CoIP-MS實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了PPFIA1的結(jié)合蛋白PARP1，闡明其通過激活核受體kappa B(NF-kB)和P65的表達(dá)而上調(diào)KIT蛋白；抑制PPFIA1或PARP1能夠下調(diào)c-KIT水平，抑制CML細(xì)胞生長(zhǎng)，延長(zhǎng)小鼠存活期?？偟膩碚f，該研究揭示了miR-181a/PPFIA1/PARP1/NFkB-P65/KIT的分子調(diào)節(jié)軸，并提出PPFIA1和PARP1可能是潛在的CML治療靶點(diǎn)。