什么是流式細(xì)胞術(shù)?
流式細(xì)胞儀通過將細(xì)胞或顆粒分離到狹窄、快速流動(dòng)的液體流中來檢測懸浮液中的細(xì)胞或顆粒。樣品通過激光,激光可檢測大小、顆粒或細(xì)胞數(shù)量、粒度和熒光等特性。
熒光標(biāo)記,通常是熒光標(biāo)記的抗體,通常用于流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn),可以提供有關(guān)細(xì)胞過程的信息,例如,細(xì)胞是活的還是死的。
熒光標(biāo)記的樣本連接到流式細(xì)胞儀,并通過流體動(dòng)力學(xué)聚焦定向成被快速移動(dòng)的流體“鞘”包圍的細(xì)液體流。 一個(gè)激光(或多個(gè)激光)聚焦在該移動(dòng)液體流上,檢測器瞄準(zhǔn)檢測前向散射、側(cè)向散射和熒光分子的同一點(diǎn)。 結(jié)合來自粒子的熒光,檢測器識別散射光。
通過軟件檢測和分析熒光發(fā)射峰處的亮度波動(dòng),該軟件提供有關(guān)粒子特性的數(shù)據(jù)。
收集樣本數(shù)據(jù)被稱為“采集”,使用的軟件可以調(diào)整參數(shù),例如通道之間的泄漏補(bǔ)償。 此外,該軟件可確保正確設(shè)置參數(shù)。
流式細(xì)胞儀的五個(gè)主要組件是流式細(xì)胞、測量系統(tǒng)、檢測器、放大系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)軟件。
什么是蛋白質(zhì)工程?
蛋白質(zhì)工程用于合成新的蛋白質(zhì),此外,可以修改(工程化)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)以實(shí)現(xiàn)所需的功能。 蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域已顯著受益于分子力場、結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)的進(jìn)步以及對蛋白質(zhì)復(fù)雜 3D 結(jié)構(gòu)的了解不斷增加。 由于知識和技術(shù)的進(jìn)步,計(jì)算方法已經(jīng)成為可能。
蛋白質(zhì)工程是一門相對較新的學(xué)科,在理解蛋白質(zhì)折疊和識別以告知蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)原則方面已經(jīng)進(jìn)行了大量研究。 蛋白質(zhì)工程策略分為兩類; 定向進(jìn)化和合理的蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)。
這兩種方法并不相互排斥,研究人員通常在蛋白質(zhì)工程中同時(shí)應(yīng)用這兩種方法。多蛋白質(zhì)工程方法包括多序列比對、協(xié)同進(jìn)化分析、多價(jià)結(jié)合和結(jié)構(gòu)預(yù)測。
蛋白質(zhì)工程基于重組DNA技術(shù)。
經(jīng)典的合理設(shè)計(jì)方法涉及定點(diǎn)誘變,其中將特定的氨基酸序列插入靶基因。 可以使用位點(diǎn)重疊法或全質(zhì)粒單輪 PCR 進(jìn)行定點(diǎn)誘變。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的序列已知時(shí),合理設(shè)計(jì)是有用的。 然而,在許多情況下,序列是未知的,這促進(jìn)了對進(jìn)化方法的需求。
高通量篩選的最新技術(shù)進(jìn)步為該領(lǐng)域的發(fā)展提供了機(jī)會(huì)。 流式細(xì)胞術(shù)是一種可以提供相關(guān)數(shù)據(jù)的技術(shù),有助于為蛋白質(zhì)工程研究提供信息。
流式細(xì)胞儀如何用于檢測蛋白質(zhì)工程
近年來,流式細(xì)胞儀在蛋白質(zhì)工程中的應(yīng)用出現(xiàn)了巨大的機(jī)遇。 可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行工程改造,使其具有特定的特性,例如配體結(jié)合、變構(gòu)、催化活性和改進(jìn)的穩(wěn)定性。 流式細(xì)胞術(shù)可以以高通量的方式檢測這些工程蛋白的生物標(biāo)志物,每分鐘對數(shù)百甚至數(shù)千個(gè)顆粒進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)。
含有工程蛋白質(zhì)的細(xì)胞被熒光標(biāo)記并通過流式細(xì)胞儀,在那里它們被軟件檢測和分析,通常需要多輪篩選才能找到具有目標(biāo)功能特性的工程蛋白。執(zhí)行該多步驟過程,直到觀察到的蛋白質(zhì)功能改善可以忽略不計(jì)或生成的蛋白質(zhì)滿足所選標(biāo)準(zhǔn)。
有多種方法可以在工程蛋白中產(chǎn)生序列多樣性,包括隨機(jī)誘變、同源體外重組或非同源重組。 無論創(chuàng)建序列多樣性的方法如何,進(jìn)化工程技術(shù)的主要障礙是傳統(tǒng)篩選過程對蛋白質(zhì)工程過程中產(chǎn)生的大量蛋白質(zhì)序列庫的限制。
流式細(xì)胞術(shù)在蛋白質(zhì)工程方面具有巨大優(yōu)勢,因?yàn)樗軌蚩焖贆z測工程細(xì)胞中表達(dá)的序列,為研究人員提供大量數(shù)據(jù),為選擇具有感興趣特性的蛋白質(zhì)提供信息。蛋白質(zhì)工程中采用的其他技術(shù)包括噬菌體展示、使用報(bào)告酶的生物測定和單孔測定。
總結(jié)
蛋白質(zhì)工程是一個(gè)相對較新的研究領(lǐng)域,越來越多地用于制造具有各種功能特性的定制蛋白質(zhì),用于藥物設(shè)計(jì)等目的。
分析大型工程蛋白質(zhì)庫的需要促進(jìn)了該領(lǐng)域高通量方法的使用。
流式細(xì)胞術(shù)就是這樣一種技術(shù),已顯示出實(shí)現(xiàn)這一要求的潛力,可在短時(shí)間內(nèi)提供研究所需的數(shù)據(jù)。
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