分子克隆是一種用于創(chuàng)建在細(xì)菌或哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的 DNA 實驗工具的技術(shù)， 分子克隆被定義為目標(biāo) DNA 序列的分離和擴增。

什么是分子克隆？

分子克隆實驗是一種將外源 DNA 片段插入能夠在宿主細(xì)胞中自主復(fù)制的載體的技術(shù)。 這種宿主細(xì)胞通常是一種細(xì)菌（ 大腸桿菌 ）。 插入 DNA 的多個拷貝的產(chǎn)生可用于多種目的。

基因調(diào)取及合成，分子克隆，cdna克隆服務(wù)，輝駿生物自有細(xì)胞實驗平臺，克隆實驗包含：從細(xì)胞或組織中提取總DNA或總RNA后擴增出目的基因;通過化學(xué)合成的方法獲得目的DNA序列。交付產(chǎn)物：含目的基因的質(zhì)粒和和甘油菌，原始測序文件和拼接文件等，2-4周可得實驗周期短，實驗結(jié)果完美。

基因調(diào)取/合成cDNA克隆服務(wù)信息

分子克隆的要求

要進(jìn)行克隆實驗，需要幾種材料。  這些包括靶DNA、宿主生物、用于克隆的載體DNA、將外源DNA插入載體的方法、將體外修飾的DNA放入宿主細(xì)胞的方法，以及選擇和/或篩選細(xì)胞的方法攜帶插入的外源 DNA。

參與分子克隆的酶

有三種類型的酶用于克隆。 這些包括限制性內(nèi)切酶、聚合酶、核酸酶、連接酶、激酶和磷酸酶。切割雙鏈 DNA 核酸 分子的識別位點處或附近稱為限制性位點 。

大多數(shù)插入的片段是由于用稱為限制酶的酶消化現(xiàn)有的 DNA 片段而產(chǎn)生的。結(jié)果，產(chǎn)生了約 100 個堿基對長度的短插入片段，這些短插入片段也可以在商業(yè)上合成為單鏈寡核苷酸，然后退火形成雙鏈片段。

聚合酶是催化 DNA 或 RNA 聚合物合成的酶，其序列與原始模板互補。DNA 核酸酶 的斷裂或裂解 磷酸二酯鍵 之間存在脫氧核糖 和 DNA 鏈主鏈中的磷酸殘基外切核酸酶是在 DNA 末端附近切割的核酸酶； 那些在 DNA 鏈 稱為 核酸內(nèi)切酶 。這些不需要用于切割的游離 DNA 末端， 一些酶具有這兩種活性。

連接酶形成磷酸二酯鍵以連接兩段 DNA；  他們利用的是在鎂離子存在下的三磷酸腺苷 (ATP)。  激酶從供體分子轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)，而磷酸酶催化磷酸殘基的去除。

載體 DNA 的選擇

起分子載體作用的 DNA 分子稱為載體。  它們將感興趣的 DNA 攜帶到宿主細(xì)胞中并促進(jìn)其復(fù)制。  克隆中使用了三種類型的載體：

1、用于克隆 DNA 小片段的質(zhì)粒，大約 10 到 15 kb

2、噬菌體 gamma：用于克隆更大的 DNA 片段（~20kb）

3、粘粒：這些質(zhì)粒含有來自噬菌體 gamma 的 DNA 序列，用于克隆更大的片段（最長 45kb）

在分離目標(biāo) DNA 序列后，將該插入片段定位到載體質(zhì)粒以產(chǎn)生構(gòu)建體，該質(zhì)粒是可在細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌中繁殖的雙鏈環(huán)狀 DNA 片段。  在實驗室中，載體通常是天然存在的質(zhì)粒的較小版本，具有以下幾個特征：

1、復(fù)制起點

2、報告基因，通常是耐藥基因

3、使 DNA 片段易于插入的獨特限制位點。   這些限制性位點通常聚集在多接頭區(qū)域或多個克隆位點中，這使研究人員能夠為多個插入片段選擇最方便的限制性酶組合。  限制性內(nèi)切酶可以在特定目標(biāo)處切割 DNA。  限制性內(nèi)切酶的選擇被認(rèn)為是設(shè)計克隆策略時的關(guān)鍵步驟。  有幾個在一處切斷雙鏈 DNA，形成平端。   其他形式的限制酶允許在貓的位點有少量堿基突出。  這些被稱為互補的粘性末端，因為它們可以很容易地相互定位，從而提高了連接反應(yīng)的效率。   這隨后增加了成功克隆事件的機會。  對限制性內(nèi)切酶組合的深思熟慮可以控制插入片段的插入方向，這對許多應(yīng)用至關(guān)重要

分子克隆策略

分子克隆有四個基本步驟：

1、由于多個克隆位點的限制性消化導(dǎo)致載體線性化。

2、將所需或目標(biāo) DNA 片段連接到細(xì)菌質(zhì)粒中：連接是將 DNA 插入載體的方法。  連接反應(yīng)的要求包括兩個或多個 DNA 片段（鈍的或粘性的）、含有 ATP 的緩沖液和 DNA 連接酶

3、將此構(gòu)建體轉(zhuǎn)化為載體，如 大腸桿菌 ：這是將體外修飾的 DNA 放入宿主細(xì)胞的方法。 在轉(zhuǎn)化過程中，細(xì)菌細(xì)胞會吸收裸露的 DNA 分子。 在此之后，細(xì)胞變得“有能力”，也就是說，可以接受 DNA 周期以實現(xiàn)這種細(xì)胞，然后用冰冷的氯化鈣處理并隨后進(jìn)行熱休克。 平均 7 到10 8 每微克DNA -3 。 轉(zhuǎn)化效率定義為用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌的每微克 DNA 的菌落形成單位 (CFU) 數(shù)。 在此之后，發(fā)生 DNA 電穿孔進(jìn)入宿主細(xì)胞。 這是電場介導(dǎo)的膜透化的一種形式； 在存在 DNA 的情況下施加高強度電場。

4、篩選陽性連接事件的存在：這是一種選擇攜帶插入 DNA 的細(xì)胞的方法。  是指應(yīng)用促進(jìn)攜帶載體或載體并插入的細(xì)胞生長的條件。  最常見的這些篩選方法包括選擇抗生素抗性、檢查營養(yǎng)需求、使用 β-半乳糖苷酶進(jìn)行藍(lán)白選擇、非常特定類型的篩選，例如使用雜交。  篩選允許細(xì)胞生長并測試生成的克隆是否存在插入片段。

在典型的 DNA 克隆程序中，將感興趣的 DNA 片段（最常見的是所需的人類蛋白質(zhì)）插入構(gòu)建體中。  這些 DNA 構(gòu)建體包括一個啟動子元件（啟動或關(guān)閉基因所需的 DNA 序列），它連接到報告基因或受啟動子控制的互補 DNA 序列。

報告基因是一種產(chǎn)生分子的基因，該分子在轉(zhuǎn)染后易于分析，該過程涉及將 DNA 或其他核酸引入真核細(xì)胞中，并可用作篩選成功轉(zhuǎn)染的標(biāo)志物。

總之，分子克隆涉及載體的制備，“轉(zhuǎn)化”是任何載體，通常是病毒或質(zhì)粒，用作載體將 DNA 序列攜帶到宿主細(xì)胞中，作為分子克隆程序的一部分。