基因組革命揭示了疾病相關(guān)基因的環(huán)境。 詢問蛋白質(zhì)的功能更加困難。 測量蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用如何響應(yīng)細胞的擾動而變化——使用化學(xué)物質(zhì)或調(diào)整基因可以揭示對在特定疾病中起作用的蛋白質(zhì)的見解。

量化蛋白質(zhì)相互作用

蛋白質(zhì)不會單獨作用。它們通常與其他蛋白質(zhì)一起進行切片和切塊并催化反應(yīng)。了解這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用或 PPI，有助于探究一個基因的突變?nèi)绾斡绊懙鞍踪|(zhì)如何相互“交談”以驅(qū)動疾病。

科學(xué)家通常一次只測量一種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。 在一個緩慢而費力的過程中，他們抓住一種蛋白質(zhì)，將其從細胞中拉出，并繪制出它與哪些蛋白質(zhì)相互作用的圖譜。 定量親和純化質(zhì)譜法或 q-AP-MS 等方法可以以更高的通量測量蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)在其天然環(huán)境（細胞）內(nèi)的變化。

在其基本形式中，q-AP-MS 的工作原理如下：細胞（或整個動物）被“喂食”大量氨基酸，隨著時間的推移，這些氨基酸會融入蛋白質(zhì)中。  平行制備其他細胞作為陰性對照。   然后用編碼待研究蛋白質(zhì)的基因轉(zhuǎn)染細胞；  蛋白質(zhì)通常用標簽進行修飾，例如 GFP，以便以后可以輕松分離。   接下來，蛋白質(zhì)從細胞中切下并穿過凝膠，凝膠中含有與蛋白質(zhì)標簽結(jié)合的抗體。  蛋白質(zhì)被切割成更小的片段，一切都通過質(zhì)譜儀運行。   結(jié)果是哪些蛋白質(zhì)與所選蛋白質(zhì)結(jié)合的定量快照。

然而，在過去幾年中，其他方法彌補了與 q-AP-MS 相關(guān)的一些缺點。 一方面，將標簽融合到感興趣的蛋白質(zhì)上可以從根本上改變蛋白質(zhì)的行為方式。 該方法還僅提供一個時間點細胞中 PPI 的快照，并且該方法偏向于強相互作用的蛋白質(zhì)； 瞬態(tài)連接更難檢測和測量。 

解決 PPI 問題

“多年來，AP-MS 實驗依賴于用相對較大的熒光蛋白 GFP 和/或其異源過度表達標記蛋白質(zhì)，”ChromoTek 高級科學(xué)家兼研發(fā)分析團隊負責人 Christian Linke-Winnebeck 說，這是 Proteintech Group 的一部分。   “當然，雖然這種方法已經(jīng)產(chǎn)生了很多知識，但感興趣的蛋白質(zhì)可能仍然受到龐大標簽和高于正常表達水平的影響?！?

這就是為什么實驗室現(xiàn)在不使用 GFP 標記，而是使用 CRISPR 直接標記基因組中的基因，以避免干擾基因的表達水平。 3 Linke-Winnebeck 說，其他團體也在使用“分裂熒光蛋白”來標記蛋白質(zhì)。 在這種情況下，“只有一小部分熒光蛋白與您感興趣的蛋白質(zhì)融合，其余部分在單獨的質(zhì)粒上表達，”他說。 “僅使用一個小片段使 CRISPR-Cas 內(nèi)源性標記方法的工作變得更加容易，”因為使用 CRISPR 插入大基因可能很困難。

在最近的預(yù)印本中，一家德國實驗室正是使用這種方法“用熒光蛋白 mNeonGreen 的片段標記人類細胞系中的 1,300 多個內(nèi)源基因，”Linke-Winnebeck 說，然后分裂開細胞并使蛋白質(zhì)通過一種含有高親和力抗體片段或納米抗體的特殊凝膠，用于 mNeonGreen，由 ChromoTek 作為 MNeonGreen-Trap 出售。  “這允許在自然環(huán)境中對 1,300 種蛋白質(zhì)進行可視化和深入分析?！?

為了實時跟蹤 PPI，并收集超出時間快照的數(shù)據(jù)，科學(xué)家們轉(zhuǎn)向了 q-AP-MS 之外的方法。 一種稱為 BRET（生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移），使用光來檢測相互作用的蛋白質(zhì)。 一種蛋白質(zhì)與熒光素酶（其作用類似于電子供體）融合，而另一種蛋白質(zhì)與熒光蛋白融合，作為受體。 當兩者靠近時，電子從供體轉(zhuǎn)移到受體，受體發(fā)出熒光。 4 該實驗甚至可以在 384 孔板中平行進行，并且可以在大約兩個小時內(nèi)測量熒光。

這可以對 PPI 進行實時的動力學(xué)分析，從而更透徹地了解 PPI 動態(tài)以及它可能如何不同，例如，在化合物治療之間或相關(guān)蛋白質(zhì)之間的差異

“這些 PPI 方法通常用于篩選工作，以識別調(diào)節(jié)目標 PPI 的新化合物，并且可以輕松適應(yīng)以更好地了解臨床相關(guān)突變?nèi)绾斡绊懠毎?PPI 及其對潛在治療干預(yù)的反應(yīng)，”丹尼爾斯說。  并且“因為這些方法允許在天然細胞環(huán)境中分析蛋白質(zhì)相互作用動力學(xué)，所以它們通常用于確認生化 PPI 研究的結(jié)果”——例如 q-AP-MS，它需要從細胞中去除蛋白質(zhì)—— “反映了細胞內(nèi)實際發(fā)生的情況。”

為了測量瞬時或微弱的蛋白質(zhì)相互作用，科學(xué)家可以使用表面等離子體共振或 SPR，這是一種無標記、基于光學(xué)的生物物理方法，其中將少量配體固定在表面上，然后是結(jié)合伙伴，例如作為蛋白質(zhì)，通過微流體流動系統(tǒng)引入。 5 當兩者結(jié)合時，反射光強度的變化（由于非?？拷鼈鞲衅鞅砻娴恼凵渎首兓┛捎糜跍y量結(jié)合在一起的分子的比例。 通過隨時間測量，這些數(shù)據(jù)用于計算結(jié)合親和力和結(jié)合/解離動力學(xué)。 通過靈敏度、自動化和并行流體的改進，現(xiàn)代 SPR 儀器每天可以例行篩選或表征 100 到 1000 次交互。

這種信息豐富的技術(shù)使我們能夠獲得多種類型的信息，包括親和力（相互作用的緊密程度或治療劑與其靶標的結(jié)合強度）、動力學(xué)（相互作用的速度）、濃度（功能活性產(chǎn)品的數(shù)量）

Belcher 說，這項技術(shù)對藥物發(fā)現(xiàn)特別有用，因為可以并行篩選大型抗體庫，以了解它們?nèi)绾闻c蛋白質(zhì)結(jié)合。  一旦確定了藥物，SPR 還可以用于在成熟過程中精確跟蹤和測量其親和力和/或動力學(xué)。

測量 PPI 以促進臨床發(fā)現(xiàn)

這三種方法——q-AP-MS、BRET 和 SPR——一起以令人印象深刻的細節(jié)繪制、測量和剖析 PPI。  他們還在藥物發(fā)現(xiàn)、基礎(chǔ)和臨床研究方面迎來了一場名副其實的革命。

在一項研究中，Scripps Research 的研究人員使用串聯(lián)質(zhì)量標簽（用于更定量和并行化質(zhì)譜的化學(xué)標簽）和 AP-MS 來研究稱為 ATF6 的轉(zhuǎn)錄因子如何控制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并“命令”它減少數(shù)量一種淀粉樣蛋白，稱為 ALLC，在細胞內(nèi)產(chǎn)生。 這一發(fā)現(xiàn)加強了我們對系統(tǒng)性淀粉樣蛋白疾病的理解，例如轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白相關(guān)的淀粉樣蛋白疾病。 

另一項研究使用 AP-MS 一次研究了 7,000 多種蛋白質(zhì)。 研究人員采用 HEK293T 腎細胞，用 2,594 種不同的“誘餌”轉(zhuǎn)染它們，并使用質(zhì)譜法揭示了 7,668 種蛋白質(zhì)中的 23,744 種相互作用。 7 其他團體進一步擴展了這項工作； 今年早些時候，不列顛哥倫比亞大學(xué)的一個團隊在包括心臟和大腦在內(nèi)的七種不同小鼠組織中繪制了超過 125,000 個 PPI。 大多數(shù)相互作用以前沒有報道過。 8 他們使用了一種有點類似于 q-AP-MS 的技術(shù)，稱為 蛋白質(zhì)相關(guān)分析 ——哺乳動物的穩(wěn)定同位素標記。

NanoBRET 也已被證明是了解癌癥相關(guān)癌基因如何隨著癌癥發(fā)展而調(diào)整蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵。 該技術(shù)用于證明與野生型 RAS 蛋白相比，NRAS 突變體與 RAS 效應(yīng)蛋白 RAF1 顯示出更大的相互作用親和力。 9 研究人員證實，在不分裂開放細胞的情況下，該突變改變了對調(diào)節(jié)癌癥很重要的 PPI 網(wǎng)絡(luò)。 Daniels 說，該論文“幫助確定了侵襲性癌癥病例背后的分子機制，為更好地預(yù)測 RAS 突變的生物學(xué)行為提供了又一步?！?

當談到我們這個時代的故事時，COVID-19，SPR 已被證明對于衡量候選藥物與病毒相互作用的結(jié)合親和力和動力學(xué)至關(guān)重要。 例如，去年，Regeneron Pharmaceuticals 發(fā)表了針對 SARS-CoV-2 的兩種抗體（casirivimab 和 imdevimab）的結(jié)合動力學(xué) 10 ； Belcher 表示，它們是世界衛(wèi)生組織推薦的單克隆療法的一部分。 在該研究中，“Biacore SPR 系統(tǒng)用于確定抗刺突 mAb 與 SARS COV2 刺突蛋白結(jié)合的結(jié)合動力學(xué)和親和力?！?

通過十年的發(fā)展，輝駿生物已經(jīng)建成了完善的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測平臺、并開展了以此為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)單項或整體課題服務(wù)。具體包含以下定量蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白定性、代謝組學(xué)實驗內(nèi)容，更多實驗服務(wù)詳情請點擊下列蛋白質(zhì)組學(xué)內(nèi)容進行查看！蛋白-蛋白互作實驗方案及價格優(yōu)惠等，歡迎撥打輝駿實驗熱線：4006991663。

定量蛋白質(zhì)組學(xué)

iTRAQ標記定量

TMT標記定量

DIA非標定量

Label free非標定量

SILAC標記定量

PRM靶向定量

Western Blot

蛋白定性

LC-MS/MS蛋白鑒定

LC-MS/MS修飾位點鑒定

代謝組學(xué)

廣泛靶向代謝組學(xué)

非靶向代謝組學(xué)

靶向代謝組學(xué)

脂質(zhì)組學(xué)