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轉(zhuǎn)錄組測序 對(duì)研究人員很重要，因?yàn)樗鼈儙椭覀兞私饧?xì)胞機(jī)器如何解釋基因組序列以及這些序列的改變。 它們對(duì)于許多功能分析也是必要的。 如果沒有適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄組注釋，就不可能進(jìn)行 RNA-seq 研究來探索差異基因表達(dá)或預(yù)測組織或生物體中存在哪些蛋白質(zhì)。

現(xiàn)在測序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到可以很快以比以前更低的成本為更廣泛的生物（包括單細(xì)胞真核生物）生成高質(zhì)量的基因組參考和轉(zhuǎn)錄組注釋的地步。雖然基因組將很快組裝成具有合理可靠性的染色體規(guī)模支架，但技術(shù)限制阻止轉(zhuǎn)錄組注釋技術(shù)識(shí)別從這些染色體表達(dá)的基因和同種型。

現(xiàn)在可以使用短讀長測序、鏈接短讀長測序、長讀長測序和光學(xué)作圖等技術(shù)的組合來構(gòu)建高質(zhì)量的“著絲粒到端?！被蚪M序列?；蚪M組裝現(xiàn)在正進(jìn)入黃金時(shí)代。從單細(xì)胞真核生物到北極熊的非模式生物將從這些強(qiáng)大且相對(duì)便宜的方法中受益匪淺，而這些方法以前缺乏以艱難的方式生成高質(zhì)量基因組參考所需的注意力和大筆資金——染色體圖譜、桑格測序細(xì)菌人工染色體文庫等。

大多數(shù)基因組組裝突破不適用于轉(zhuǎn)錄組注釋。短讀長和長讀長測序技術(shù)現(xiàn)在用于轉(zhuǎn)錄組注釋，但是，它們都存在缺陷，使得實(shí)現(xiàn)“參考級(jí)”轉(zhuǎn)錄組注釋既耗時(shí)又困難。

異構(gòu)體的全長轉(zhuǎn)錄組測序工作流程

300 ng 總 RNA 用于異構(gòu)體測序。選擇 poly-A RNA 后，將其轉(zhuǎn)化為 cDNA，為文庫組裝做準(zhǔn)備。此外，最多可對(duì) 12 個(gè)樣品進(jìn)行多重分析，以實(shí)現(xiàn)一種簡化且經(jīng)濟(jì)高效的方法。

獲得測序數(shù)據(jù)后，選擇兩側(cè)有 cDNA 引物和 poly-A 尾的讀數(shù)作為全長讀數(shù)。然后可以按轉(zhuǎn)錄本異構(gòu)體對(duì)讀數(shù)進(jìn)行分組，以產(chǎn)生獨(dú)特的共識(shí)。

然后可以將異構(gòu)體映射到參考基因組，并且可以使用 SQANTI 和 Maker 等工具以基于參考的方式注釋異構(gòu)體。PacBio 的 Iso-Seq 分析采用一鍵式生物信息學(xué)程序來處理同種型數(shù)據(jù)，而無需參考基因組或從頭方法注釋。

全長轉(zhuǎn)錄本測序的應(yīng)用

基因組注釋是的首次應(yīng)用全長轉(zhuǎn)錄序列。這在植物和動(dòng)物科學(xué)中特別有用，其中基因組通常比人類基因組復(fù)雜得多，并且參考質(zhì)量的基因組組裝可能仍然非常昂貴。

全長轉(zhuǎn)錄本還有助于表征以前由于片段重復(fù)而難以識(shí)別的人類基因。研究人員觀察了在大腦中表達(dá)的具有長片段重復(fù)的 19 個(gè)基因家族，發(fā)現(xiàn)由于新的轉(zhuǎn)錄起始、剪接和聚腺苷酸化位點(diǎn)，近一半的表達(dá)基因重復(fù)與其祖先模型發(fā)生了顯著變化。

其他人已經(jīng)采用全長 RNA 測序以類似的方式分析可變剪接和多聚腺苷酸化譜，但這次是在物種之間。