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肝臟是人體內(nèi)最大的器官，在營養(yǎng)和能量代謝方面起著至關(guān)重要的作用。肝臟代謝紊亂將導(dǎo)致Ⅱ型糖尿病、血脂異常和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的產(chǎn)生。非酒精性脂肪肝炎（NASH）是NAFLD最極端的形式，也是肝硬化和肝細(xì)胞癌等終末期肝病的主要病因。

以往的研究發(fā)現(xiàn)肝內(nèi)存在多種受體配體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方式，且這種信號通訊在維持肝內(nèi)組織穩(wěn)態(tài)及肝損傷反應(yīng)過程起到重要作用。盡管如此，單細(xì)胞水平下的細(xì)胞間通訊圖譜及NASH發(fā)病過程中肝細(xì)胞的異質(zhì)性特點(diǎn)仍未被闡明。

本研究通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序鑒定得到健康和NASH小鼠肝臟非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPC）細(xì)胞圖譜，解析了在NASH過程中肝細(xì)胞間受體配體相互作用，并發(fā)現(xiàn)一種NASH相關(guān)的巨噬細(xì)胞，可能作為NASH治療的良好靶標(biāo)。

1. 肝臟NPC的單細(xì)胞圖譜

為了探究NASH的發(fā)病機(jī)制，作者首先對健康和NASH小鼠的肝臟進(jìn)行了常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測序，與健康組相比，共篩選到772個(gè)差異基因，包括311個(gè)下調(diào)基因和461個(gè)上調(diào)基因（Fig. 1A-C）。對這些差異基因進(jìn)行GO富集分析，發(fā)現(xiàn)下調(diào)基因主要富集在脂質(zhì)代謝和氧化反應(yīng)相關(guān)的GO條目；上調(diào)的基因則富集到細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞粘附、吞噬和免疫反應(yīng)等GO條目，而這些功能主要由肝臟中的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPC）承擔(dān)，表明在NASH發(fā)病機(jī)制中，NPC可能承擔(dān)著較為重要的作用。因此作者從肝臟中分離了NPC進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，以探究肝臟中NPC的異質(zhì)性特點(diǎn)及其在NASH發(fā)病過程中的作用。

對健康和NASH小鼠肝臟NPC進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序分析，共獲得33,168個(gè)細(xì)胞，鑒定到內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞等10種細(xì)胞類型(Fig1D-1F)，這些細(xì)胞類型在小鼠和人類之間表現(xiàn)出高度保守的轉(zhuǎn)錄特征(Fig. 1G)。將RNA-seq與scRNA-seq的結(jié)果聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)由NASH誘導(dǎo)上調(diào)的基因主要分布在巨噬細(xì)胞和肝星狀細(xì)胞（HSC）中，NASH肝臟中下調(diào)的基因分布在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中(Fig. 1I)。

Fig. 1健康和NASH小鼠肝臟NPCs的scRNA-Seq分析

2. 單細(xì)胞水平的分泌因子與受體相互作用分析

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序得到305個(gè)分泌因子與147個(gè)膜受體, 這些分泌因子與受體基因在不同的細(xì)胞類型中特異性表達(dá)，且表達(dá)模式在人和小鼠間高度保守（Fig.2A-C）。作者在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了肝臟不同細(xì)胞間信號傳遞的高分辨圖譜，其中HSCs、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是旁分泌和自分泌信號的重要中心(Fig. 2D)。

Fig. 2 肝細(xì)胞分泌基因分析

3. 內(nèi)皮細(xì)胞的血管信號傳導(dǎo)功能

內(nèi)皮細(xì)胞是NPC中最大的細(xì)胞群，共10,447個(gè)細(xì)胞，將內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行二次聚類可得到4個(gè)亞群，分別為門靜脈周圍(Endo-pp)內(nèi)皮細(xì)胞、中心周圍(Endo-PC)內(nèi)皮細(xì)胞，以及兩個(gè)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞簇(LSEC-1和LSEC-2)，這些亞群獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄特征使它們能夠在肝臟內(nèi)不同的區(qū)域發(fā)揮不同的功能(Fig. 3A-C)。

為了探究NASH對內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，作者結(jié)合scRNA-seq及內(nèi)皮轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，發(fā)現(xiàn)來源于NASH肝的內(nèi)皮細(xì)胞表現(xiàn)出與脂質(zhì)代謝、抗原呈遞和趨化因子釋放相關(guān)的基因表達(dá)量增加，而與血管發(fā)育和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)有關(guān)的基因顯著下調(diào)，對此作者通過流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光驗(yàn)證對上述結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證（Fig. 3E,F），并推測由于內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的重編程導(dǎo)致了NASH期間竇狀毛細(xì)血管的嚴(yán)重?fù)p傷。同時(shí)，在NASH樣本中內(nèi)皮細(xì)胞的膜受體及血管分泌因子（配體）的mRNA顯著下調(diào)（Fig. 3H）表明在NASH期間血管和血管分泌素信號傳導(dǎo)存在嚴(yán)重中斷，并且這種中斷也同時(shí)發(fā)生在人類NASH患者中(Fig. 3I)。

Fig. 3 內(nèi)皮細(xì)胞亞群分析

4. NASH相關(guān)巨噬細(xì)胞的出現(xiàn)及其分子標(biāo)記

通過分析健康和NASH來源的巨噬細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)NASH組的巨噬細(xì)胞顯著增多（Fig. 4A），對這些巨噬細(xì)胞進(jìn)行亞型分析，可分為庫普弗細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞 (MDMs) (Fig. 4A.B)。為了探究NASH如何改變巨噬細(xì)胞的功能特性，作者開發(fā)了一種通過基因表達(dá)特征來定量評估巨噬細(xì)胞極化水平的算法，巨噬細(xì)胞極化指數(shù)(MPI)越高，炎癥表型越顯著，通過這一分析證實(shí)了NASH會(huì)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)變（Fig. 4C），這與NASH疾病進(jìn)程中的促炎環(huán)境相吻合。

接下來作者進(jìn)一步分析了巨噬細(xì)胞的亞型特點(diǎn)，通過Trem2的表達(dá)可將KCs分為Trem2lo和Trem2hi兩群（Fig. 4D），由于超過93%的Trem2hi來源于NASH，因此把這群細(xì)胞命名為NASH相關(guān)的巨噬細(xì)胞“NASH-associated macrophages”(NAMs)。另外，NAMs還高表達(dá)Gpnmb 和Cd9，這些基因可作為NASH的生物標(biāo)記物。

Fig. 4 NASH相關(guān)巨噬細(xì)胞的鑒定

5. 肝星狀細(xì)胞的受體配體信號網(wǎng)絡(luò)

該研究另一項(xiàng)重要的發(fā)現(xiàn)是肝星狀細(xì)胞活躍的信號傳遞功能。通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序共獲得272個(gè)肝星狀細(xì)胞（HSC），HSC的分泌組十分豐富，包含了多個(gè)編碼膜蛋白和分泌因子的基因，作者選取了表達(dá)較活躍的分泌組基因構(gòu)建了配體-受體信號網(wǎng)絡(luò)，并將這一群獨(dú)特的分泌因子命名為“Stellakines”，從網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出這些Stellakines作用的主要細(xì)胞靶點(diǎn)是內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞（Fig. 5B）。同時(shí)，肝星狀細(xì)胞表面還富集了多種受體，使其能夠?qū)Σ煌募?xì)胞外信號作出反應(yīng)，起到肝內(nèi)信號傳遞樞紐的作用(Fig. 5D)。

最后作者對肝星狀細(xì)胞中的血管活性激素信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行分析，并證實(shí)Stellakines的表達(dá)受到IL11自分泌信號的調(diào)控。雖然沒有明確IL11的病理作用，但指出Stellakines的分泌失調(diào)是NASH進(jìn)程中肝星狀細(xì)胞的一個(gè)重要生物學(xué)特點(diǎn)。

Fig. 5 HSC信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)

研究結(jié)論

本研究基于scRNA-seq測序，單細(xì)胞分辨率下繪制了主要的肝細(xì)胞群體中分泌配體和膜受體的轉(zhuǎn)錄圖譜，并構(gòu)建了配體-受體信號網(wǎng)絡(luò)，為解構(gòu)穩(wěn)態(tài)和疾病中細(xì)胞間通訊的動(dòng)態(tài)性質(zhì)提供了藍(lán)圖。

蛋白組/代謝組實(shí)驗(yàn)

? iTRAQ 定量蛋白質(zhì)組學(xué)

? Label Free 實(shí)驗(yàn)檢測服務(wù)

? LC-MS/MS 蛋白質(zhì)譜鑒定

? DIA 全息掃描定量蛋白質(zhì)
? 廣泛靶向代謝組學(xué)

蛋白/核酸相互作用實(shí)驗(yàn)

? GST pull down

? RNA pull down

? DNA pull down

? Co-IP 免疫共沉淀

? TAP-MS串聯(lián)親和純化

分子細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)

? 基因調(diào)取/合成 (cDNA克隆)

? 熒光定量PCR (qPCR)

? 載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)服務(wù)

? miRNA靶基因驗(yàn)證
? 慢病毒包裝

科研產(chǎn)品

? 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體

? 人cDNA克隆庫

? 慢病毒表達(dá)載體

? 慢病毒干擾載體

抗體工程服務(wù)

? 單克隆抗體測序

? 抗體從頭測序

? 抗體表達(dá)服務(wù)

? 重組抗體表達(dá)

實(shí)驗(yàn)試劑盒

? RNA pull down 試劑盒

? GST pull down 試劑盒

? COIP 試劑盒

? Flag 試劑盒