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背景：肝細(xì)胞癌(HCC)是全球第五大最流行的惡性腫瘤和第二大與癌癥相關(guān)的死亡原因。它的發(fā)生歸因于代謝物相關(guān)基因調(diào)控改變引起的細(xì)胞代謝重編程。有證據(jù)表明，糖代謝異常是癌癥的突出特征，然而有關(guān)糖原調(diào)節(jié)的異常很少被研究。因此，明確這種異常代謝的機(jī)制或許可以為肝細(xì)胞癌的治療提供新的靶點(diǎn)。

內(nèi)容概述：
2019年2月，輝駿生物合作伙伴，中山大學(xué)腫瘤中心華南腫瘤學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在期刊Cancer Research（IF₂₀₁₉=9.727）上發(fā)表題為“A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma”的最新論文，證明了糖原合成酶2(GYS2)通過(guò)p53的負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)來(lái)限制乙肝病毒相關(guān)性肝癌的生長(zhǎng)。GYS2在HCC中的表達(dá)明顯下調(diào)，并與糖原含量降低和不良患者預(yù)后相關(guān)。GYS2的低表達(dá)可通過(guò)調(diào)控p53來(lái)促進(jìn)細(xì)胞體外增殖和體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)。GYS2與MDM2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，阻止MDM2介導(dǎo)的p53泛素化和降解；GYS2還增強(qiáng)了p300誘導(dǎo)的p53蛋白K373/382位點(diǎn)的乙?；M(jìn)而負(fù)反饋抑制了HBx/HDAC1復(fù)合物支持下的GYS2轉(zhuǎn)錄。研究結(jié)果提示：GYS2在HCC中作為一個(gè)預(yù)后因子和腫瘤抑制因子發(fā)揮作用，本研究中發(fā)現(xiàn)的HBx/GYS2/P53信號(hào)通路能夠調(diào)節(jié)糖原代謝，為肝癌的臨床治療提供了一個(gè)有前途的治療靶點(diǎn)。

主要技術(shù)：
Co-IP、RNA seq、ChIP、GST pull-down、雙熒光素酶分析等；
輝駿生物為本研究提供了GST pull down技術(shù)服務(wù)。

研究路線：

研究結(jié)果：
1. 肝細(xì)胞癌中糖原含量降低
研究者通過(guò)PAS染色分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中的糖原與非腫瘤組織相比明顯減少(圖1A)。對(duì)768例HCC患者組成的樣本進(jìn)行PAS染色，根據(jù)陽(yáng)性染色比例將患者分為高PAS組和低PAS組，Kaplan-Meier分析顯示低PAS染色與總體生存情況不良相關(guān)(圖1D)，多變量Cox回歸模型進(jìn)一步顯示糖原含量是HCC總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。這些數(shù)據(jù)表明，肝細(xì)胞癌中糖原合成受到抑制。  

2. GYS2在肝細(xì)胞癌中下調(diào)，并與不良患者預(yù)后相關(guān)    
8對(duì)肝癌組織的RNA-seq轉(zhuǎn)錄譜顯示：涉及糖原合成和代謝很多基因下調(diào)，其中GYS2顯著下調(diào)(圖2A)。之后分別對(duì)HCC細(xì)胞系、HCC新鮮腫瘤組織的mRNA和蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，qPCR、Western Blot、免疫組化實(shí)驗(yàn)均證實(shí)GYS2在HCC樣本中表達(dá)下調(diào)(圖2B-F)， PAS染色結(jié)果顯示GYS2表達(dá)與糖原含量呈正相關(guān) (圖2F)。Kaplan-Meier分析顯示，GYS2缺乏的患者在SYSUCC和癌癥基因組圖譜中的總體存活率都不佳(圖2G)。多變量Cox回歸模型和分層生存分析進(jìn)一步表明GYS2是影響HCC總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

3. GYS2缺失促進(jìn)肝癌體內(nèi)外增殖
為了探討GYS2在HCC中的生物學(xué)功能，研究者在HepG2和QGY-7703細(xì)胞中敲除GYS2，在Bel-7402和Bel-7404細(xì)胞中過(guò)表達(dá)GYS2(圖3A)，并進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)。MTT結(jié)果顯示GYS2沉默導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力顯著增加，而過(guò)表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力下降(圖3B)。EdU實(shí)驗(yàn)表明GYS2基因敲除可顯著誘導(dǎo)EDU陽(yáng)性細(xì)胞，過(guò)表達(dá)使EDU陽(yáng)性細(xì)胞減少(圖3C)。流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示沉默GYS2的細(xì)胞阻滯于S-G2-M期，過(guò)表達(dá)GYS2導(dǎo)致更多細(xì)胞處于G0-G1期(圖3D)。此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)表明GYS2缺失促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖，過(guò)表達(dá)則削弱細(xì)胞增殖(圖3E)。為了在體內(nèi)驗(yàn)證這些效應(yīng)，研究者建立了裸鼠皮下注射細(xì)胞的異種移植模型。與對(duì)照組相比，GYS2沉默的荷瘤細(xì)胞生長(zhǎng)更快，糖原含量更少，Ki-67表達(dá)更高(圖3F)。這些發(fā)現(xiàn)表明，缺乏GYS2極大地促進(jìn)了肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

4. GYS2激活p53信號(hào)通路
為了揭示GYS2介導(dǎo)肝癌增殖的潛在機(jī)制，研究者在敲除GYS2的HepG2和QGY-7703細(xì)胞中進(jìn)行了RNA seq分析，發(fā)現(xiàn)p53通路都受到了明顯抑制（圖4A）；之后在過(guò)表達(dá)/干擾GYS2的細(xì)胞中分別檢測(cè)了p53及其靶蛋白的含量，發(fā)現(xiàn)GYS2過(guò)表達(dá)促進(jìn)p53蛋白水平升高，進(jìn)而調(diào)控了p53的靶基因，如p21，14-3-3S和cyclin D1(圖4B)。接下來(lái)研究者通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)研究了這兩個(gè)蛋白之間的相互作用(圖4C)，又通過(guò)GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了GYS2與p53直接結(jié)合(圖4D和E)，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)p53的1-101aa區(qū)和GYS2的1-500aa區(qū)是兩者結(jié)合所必需的(圖4F和G)。為了驗(yàn)證GYS2是否通過(guò)p53發(fā)揮抗肝癌作用，研究者進(jìn)行了功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)?；謴?fù)p53表達(dá)可部分減弱GYS2缺失對(duì)HepG2和QGY-7703細(xì)胞生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。這些數(shù)據(jù)表明，GYS2在肝癌細(xì)胞中通過(guò)與p53的相互作用發(fā)揮腫瘤抑制作用。

5. GYS2通過(guò)與MDM2的競(jìng)爭(zhēng)性相互作用穩(wěn)定p53
為探索GYS2上調(diào)p53的機(jī)制，使用放線菌酮CHX（翻譯抑制劑）處理細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GYS2過(guò)表達(dá)顯著延緩了p53蛋白的降解(圖5A)。使用MG-132（蛋白酶體抑制劑）預(yù)處理GYS2過(guò)表達(dá)細(xì)胞，p53泛素化的IP-WB結(jié)果顯示其泛素化水平減弱 (圖5B），此外，MG-132的預(yù)處理可抵消si-GYS2對(duì)p53蛋白水平的抑制 (圖5C)。

由于E3泛素連接酶MDM2對(duì)p53泛素化起關(guān)鍵調(diào)控作用，他們接著探索了MDM2是否參與GYS2對(duì)p53的作用。p53泛素化的IP-WB結(jié)果表明，GYS2過(guò)表達(dá)減弱了MDM2過(guò)表達(dá)引起的p53泛素化增加，而si-GYS2阻斷了si-MDM2對(duì)p53泛素化的抑制(圖5D)。si-MDM2和si-GYS2共處理細(xì)胞時(shí)，WB結(jié)果顯示對(duì)si-MDM2顯著抑制了si-GYS2對(duì)p53蛋白的下調(diào) (圖5E)。

接下來(lái)，研究者通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GYS2、p53和MDM2相互結(jié)合形成了蛋白質(zhì)復(fù)合物(圖5F)。GST pull-down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了GYS2與MDM2的直接結(jié)合(圖5G)。此外，MDM2和p53之間的相互作用因GYS2的下調(diào)而增強(qiáng)，因GYS2的過(guò)表達(dá)而減弱(圖5H和I)。這些數(shù)據(jù)表明，GYS2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合MDM2來(lái)抑制p53泛素化，從而穩(wěn)定p53蛋白。

6. P53通過(guò)依賴p300的負(fù)反饋環(huán)抑制GYS2
鑒于GYS2在p53介導(dǎo)的異常糖原代謝中有作用，作者又在p53過(guò)表達(dá)/干擾情況下檢測(cè)了GYS2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)si-p53上調(diào)了GYS2的mRNA和蛋白水平(圖6B)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p53蛋白降低了GYS2啟動(dòng)子的活性(圖6C)；ChIP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了p53蛋白與GYS2啟動(dòng)子的結(jié)合(圖6D)。以上結(jié)果表明p53可以負(fù)反饋調(diào)節(jié)GYS2。

p53的轉(zhuǎn)錄后修飾是其功能所必需的，例如p300可介導(dǎo)p53蛋白K373/382處的乙?；?，增強(qiáng)其結(jié)合靶DNA的能力，因此研究了p300是否影響p53對(duì)GYS2的調(diào)控。作者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)GYS2增加了p53在K373和 K382位點(diǎn)的乙?；?(圖6E)，但當(dāng)敲除p300后，這一作用消失（圖6F)。用特異性p300抑制劑C646或si-p300處理細(xì)胞，可以消除p53介導(dǎo)的GYS2水平下降(圖6G)。構(gòu)建不能被p300乙?；?個(gè)p53突變體（p53-K373A和 p53-K382A）并分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)GYS2 mRNA和蛋白的減少較少(圖6H)，此外，在表達(dá)p53-K373A或p53-K382A的細(xì)胞中，p53對(duì)GYS2啟動(dòng)子的抑制作用和結(jié)合減弱(圖6I和J)。這些結(jié)果表明，在負(fù)反饋環(huán)中，p53通過(guò)p300介導(dǎo)的乙酰化在轉(zhuǎn)錄水平上抑制GYS2。

7. HBx-HDAC1復(fù)合物促進(jìn)p53介導(dǎo)的GYS2抑制作用
HBV編碼的關(guān)鍵致癌蛋白HBx在糖原代謝中的作用尚不明確。分別在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)或敲除HBx，PAS染色結(jié)果顯示HBx過(guò)表達(dá)減少了HCC細(xì)胞中的糖原含量，而HBx敲除恢復(fù)了這一趨勢(shì)(圖7A)。在HBx陽(yáng)性的病例中，GYS2的低表達(dá)和PAS染色更常見(jiàn)(圖7B)，而在HBx陰性的肝癌細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)HBx下調(diào)了GYS2的表達(dá)(圖7C)。據(jù)報(bào)道，HBx需要招募協(xié)同因子來(lái)發(fā)揮活性抑制作用，而組蛋白去乙酰化酶(HDAC)是與HBx相互作用的主要基因抑制因子。研究者用HDAC家族蛋白的siRNA處理肝癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)HDAC1 被敲除時(shí)，GYS2表達(dá)上調(diào)。Co-IP實(shí)驗(yàn)也顯示了HBx、HDAC1和細(xì)胞核內(nèi)乙?；膒53之間的相互作用(圖7D)。在HBx過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，HDAC1或p53的敲除部分減弱了GYS2 mRNA的損失 (圖7E)。熒光素酶和ChIP實(shí)驗(yàn)也表明，HDAC1或p53的敲除降低了HBx與GYS2啟動(dòng)子的結(jié)合(圖7F和G)。這些數(shù)據(jù)表明，HBx與HDAC1共同促進(jìn)了HBV陽(yáng)性肝癌中p53對(duì)GYS2表達(dá)的抑制。

結(jié)論：
本研究首次報(bào)道了HCC組織中糖原含量顯著降低，并與不利的患者預(yù)后相關(guān)，這歸因于新鑒定的HBx/GYS2/p53信號(hào)軸。GYS2沉默通過(guò)靶向p53信號(hào)通路促進(jìn)HCC細(xì)胞增殖而非遷移，并提供了兩條獨(dú)立的證據(jù)線來(lái)支持GYS2和p53之間的關(guān)系。一方面，確定p53是GYS2的下游靶點(diǎn)，GYS2在細(xì)胞質(zhì)中與p53相互作用，與MDM2競(jìng)爭(zhēng)以穩(wěn)定p53免于蛋白酶體降解；另一方面，p53以負(fù)反饋方式抑制GYS2表達(dá)和糖原含量。這些數(shù)據(jù)表明p53和GYS2可能通過(guò)平衡彼此的表達(dá)而在HCC中發(fā)揮功能。