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背景：

慢性病毒感染和腫瘤微環(huán)境可促使病毒特異性或腫瘤特異性T細(xì)胞耗盡，導(dǎo)致其增殖能力和效應(yīng)功能嚴(yán)重受損，使免疫反應(yīng)無法清除病毒或排斥腫瘤。T細(xì)胞共抑制受體最被認(rèn)為是慢性病毒感染和腫瘤背景下T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。對抗T細(xì)胞衰竭的癌癥免疫治療的關(guān)鍵點在于成功阻斷共抑制信號，從而重新激活免疫反應(yīng)。然而，慢性病毒感染、腫瘤發(fā)生和共抑制配體表達(dá)之間的相互作用仍尚不明確。

內(nèi)容概述：
2018年3月，輝駿生物合作伙伴，中國科學(xué)院先天免疫與慢性病重點實驗室在國際期刊Nature Communications（IF₂₀₁₇=12.353）上發(fā)表題為“Oncofetal gene SALL4 reactivation by hepatitis B virus counteracts miR-200c in PD-L1-induced T cell exhaustion”的最新論文。這項研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌患者腫瘤中的SALL4或PD-L1表達(dá)與miR-200C水平呈負(fù)相關(guān)，且SALL4或PD-L1水平低而miR-200C水平高的患者生存期較長。高水平的miR-200C直接靶向CD274 (編碼PD-L1)來降低其表達(dá)，并逆轉(zhuǎn)抗病毒CD8+T細(xì)胞的耗竭。作者發(fā)現(xiàn)，成年期HBV誘導(dǎo)導(dǎo)致STAT3激活，使SALL4蛋白重新表達(dá)，從而抑制miR-200c轉(zhuǎn)錄。HBV-pSTAT3-SALL4-miR-200C信號通路可調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)，針對該通路的治療策略可能會逆轉(zhuǎn)病毒誘導(dǎo)的免疫衰竭。

主要技術(shù)：
ChIP、慢病毒、雙熒光素酶報告基因、基因過表達(dá)/干擾等；
輝駿生物為本研究提供了shRNA慢病毒載體構(gòu)建服務(wù)。

研究路線：

 
研究結(jié)果：
1. 肝癌組織中SALL4和PD-L1與miR-200C呈負(fù)相關(guān)
PD-L1在多種惡性腫瘤中起著重要作用，微陣列分析表明miR-200c是HCC標(biāo)志物之一，此外，SALL4在HCC中高表達(dá)且與不良預(yù)后有關(guān)。miRNA分析工具顯示miR-200c能結(jié)合PD-L1的3’UTR，另外，miR-200C的啟動子區(qū)域預(yù)測有轉(zhuǎn)錄因子SALL家族的3個結(jié)合位點 (圖1A)。研究者為了分析PD-L1，SALL4和miR-200C三者之間的關(guān)系，選取了98例肝癌患者的腫瘤組織，通過免疫組化染色和原位雜交方法分別檢測腫瘤中心和周圍區(qū)域PD-L1，SALL4和miR-200C的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)三者表達(dá)均顯著高于癌旁(圖1C-E)，不過SALL4或PD-L1的表達(dá)高得多，且表達(dá)水平相當(dāng)，而miR-200c相對較低，這說明SALL4、PD-L1和miR-200C在HCC進展過程中可能有密切關(guān)系。研究者分析了每個HCC患者腫瘤中心區(qū)域SALL4、miR-200C和PD-L1表達(dá)之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-200c與SALL4或PDL1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(圖2A，E)。研究者還檢測了可能影響PD-L1的miR-200a和miR-383的水平，未分析它們與肝癌患者SALL4和PD-L1表達(dá)的關(guān)系。說明miR-200家族與SAL4或PDL1之間的負(fù)相關(guān)對miR-200c來說是更特異的（圖1）。

                 
                                                                                             （圖1）
 

                  
                                                                                            （圖2）

2. SALL4和miR-200c與總生存期相關(guān)
PD-L1與預(yù)后的相關(guān)性已經(jīng)在幾種人類癌癥中得到證實，基于SALL4和miR-200c與PD-L1表達(dá)有相關(guān)性，作者評估了SALL4和miR-200c的潛在預(yù)后價值。統(tǒng)計學(xué)分析表明，正如預(yù)期一樣，PD-L1在腫瘤中心的表達(dá)與總生存率（OS）呈負(fù)相關(guān)，癌旁無相關(guān)性(圖3A-C)。在同一肝癌組中，腫瘤中心和癌旁的miR-200c水平與OS也存在正相關(guān)(圖3D-F)。與PD-L1相似，SALL4在腫瘤中心的表達(dá)與OS呈負(fù)相關(guān)，癌旁無相關(guān)性(圖3G-I) 。綜合分析表明SALL4或miR-200c在腫瘤中心區(qū)的水平有重要的預(yù)后價值，可能成為肝癌生存預(yù)測指標(biāo)。

3. miR-200c下調(diào)HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)
HBV慢性感染是肝細(xì)胞癌變的關(guān)鍵因素，為了檢查其潛在機制，作者使用HBV感染人肝細(xì)胞系HLCZ01，發(fā)現(xiàn)PD-L1在HBV感染細(xì)胞中的水平顯著高于未感染細(xì)胞；另外，通過向小鼠體內(nèi)注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒制備HBV感染小鼠模型，發(fā)現(xiàn)PDL1的水平也顯著高于未感染小鼠。
作者在HBV感染的HLCZ01細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染miR-200c、miR-200a和miR-383的模擬物或抑制劑，并檢測PD-L1水平，結(jié)果顯示miR-200c模擬物或抑制劑分別可抑制或促進PD-L1表達(dá)，而miR-200a和miR-383都不影響PD-L1水平(圖4A)；并且miR-200c對PD-L1表達(dá)的影響呈劑量依賴性(圖4B)。研究者采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證miR-200c是否直接靶向PD-L1的3?UTR，結(jié)果顯示，miR-200C模擬物顯著降低熒光素酶活性，而miR-200C抑制劑顯著增強熒光素酶活性（圖4C），表明miR-200c直接靶向PD-L1。為了探討miR-200c是否拮抗HBV對PD-L1表達(dá)的影響，作者用HBV感染HLCZ01細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-200c的表達(dá)被顯著抑制(圖4D)。另一方面，將miR-200c模擬物轉(zhuǎn)染到HBV陽性的HLCZ01細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR-200c幾乎完全阻斷了HBV介導(dǎo)的PD-L1表達(dá)的上調(diào)，表明miR-200c可抑制HBV介導(dǎo)的PD-L1上調(diào)(圖4E)。構(gòu)建miR-200c過表達(dá)載體并注射到HBV持續(xù)感染的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)miR-200c的過表達(dá)顯著減弱了HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞PD-L1表達(dá)的上調(diào)(圖4G,H)。這些結(jié)果表明，HBV和miR-200c相互拮抗影響PD-L1表達(dá)。
 

4. miR-200c逆轉(zhuǎn)HBV陽性小鼠CD8+T細(xì)胞耗竭
結(jié)合之前的報道，為進一步證實肝細(xì)胞上PD-L1的升高會損害肝臟CD8+T細(xì)胞的活化，研究者構(gòu)建了小鼠PD-L1過表達(dá)載體并注射到HBV小鼠模型體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞上PD-L1的升高會導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞的耗竭；而當(dāng)過表達(dá)miR-200c時，可逆轉(zhuǎn)CD8+T細(xì)胞的功能衰竭（圖5A-G），miR-200c在體內(nèi)還可促進HBV特異性CD8+T細(xì)胞的功能（圖5H-K）。同時，miR-200c過表達(dá)顯著降低了HBV小鼠血清中HBV DNA和HBsAg的水平，以及肝臟組織種HBsAg和HBcAg的水平，意味著miR-200c對 PD-L1的抑制可恢復(fù)抗病毒的CD8+T的細(xì)胞功能，促進抗病毒免疫抑制HBV。在小鼠模型實驗中，在注射miR-200c質(zhì)粒一周后再注射HBV質(zhì)粒，研究者發(fā)現(xiàn)預(yù)先注射了miR-200c質(zhì)粒的小鼠血清中的HBV DNA和HBsAg水平顯著較低，表明miR-200c過表達(dá)可能通過改善T細(xì)胞功能而抑制HBV。

 
5. HBV通過STAT3誘導(dǎo)SALL4下調(diào)miR-200C的表達(dá)
研究者發(fā)現(xiàn)，miR-200c模擬物和抑制劑都不會直接降低體外肝細(xì)胞中HBsAg和HBcAg的表達(dá)，而HBV感染顯著抑制了miR-200c。已有報道指出STAT3可促使多種細(xì)胞中PD-L1表達(dá)上調(diào)，因此推測STAT3在該過程中可能發(fā)揮作用。通過比較HBV感染和未感染的肝癌細(xì)胞系中，發(fā)現(xiàn)HBV可增加STAT3的磷酸化水平，促進STAT3激活(圖6A)。

序列分析顯示，-1.5kb的SALL4啟動子區(qū)有4個潛在的STAT3結(jié)合位點 (圖6B)。當(dāng)STAT3抑制劑WP1006處理HBV感染的細(xì)胞后，SALL4表達(dá)顯著降低(圖6C)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了STAT3在SALL4表達(dá)調(diào)控中的作用：IL-6刺激可顯著增強SALL4啟動子活性，WP1006處理可顯著降低SALL4啟動子活性 (圖6D)。 ChIP實驗也表明內(nèi)源STAT3可以直接與SALL4的啟動子區(qū)結(jié)合(圖6E)。接下來，研究者探討了SALL4是否參與miR-200C的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示，沉默SALL4顯著增強了miR-200C的表達(dá)，并導(dǎo)致HBV誘導(dǎo)的PD-L1表達(dá)降低；而過表達(dá)SALL4顯著降低了miR-200C的轉(zhuǎn)錄，增強了PD-L1的表達(dá)(圖7B-E)。雙熒光素酶報告基因和ChIP實驗進一步證實，SALL4抑制了miR-200C的啟動子活性(圖7I)，并能直接與miR-200C的啟動子區(qū)域結(jié)合(圖7J)。

這些結(jié)果表明，HBV通過激活STAT3，進而促進轉(zhuǎn)錄抑制因子SALL4的表達(dá)，SALL4再與miR-200C啟動子區(qū)域結(jié)合來下調(diào)miR-200C。

 

6. 沉默SALL4會阻礙HBV復(fù)制和CTL耗盡
為了進一步證實SALL4在體內(nèi)促進HBV保持和HCC發(fā)展的作用，通過沉默肝臟中SALL4的表達(dá)，以觀察其對HBV小鼠模型的HBV感染或保持的影響(圖8A，B)。發(fā)現(xiàn)HBV+小鼠的SALL4和PD-L1表達(dá)較高，而miR-200C水平較低；沉默SALL4顯著增強了miR-200c的轉(zhuǎn)錄，降低了PD-L1的表達(dá)(圖8C，D)。此外，沉默SALL4顯著增加了干擾素-γ+CD8+T細(xì)胞的百分比，降低了CD8+T細(xì)胞上PD-1的表達(dá)，并抑制CD8+T細(xì)胞的凋亡(圖8E)，同時降低了HBV+小鼠的HBsAg和HBeAg水平(圖8F)。免疫熒光染色法檢測結(jié)果顯示，SALL4在腫瘤中心區(qū)域的表達(dá)明顯高于癌旁，而腫瘤浸潤的CD8+T細(xì)胞在腫瘤中心區(qū)域的含量明顯低于癌旁(圖9A)，統(tǒng)計分析表明，SALL4表達(dá)與腫瘤浸潤的PD-1+CD8+T細(xì)胞呈正相關(guān)(圖9B)，表明肝細(xì)胞SALL4可能通過表達(dá)PD-L1參與HBV陽性HCC發(fā)展過程中PD-1+CD8+T細(xì)胞的耗竭。
 

結(jié)論：
本研究首次發(fā)現(xiàn)了HBV重新激活STAT3，通過STAT3-SALL4-miR-200c-PDL1通路促進HCC發(fā)展，并闡明了慢性病毒感染在CD8+T細(xì)胞衰竭和腫瘤進展中的作用，這是一種從內(nèi)在(如HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞PD-L1表達(dá))到外在(如肝細(xì)胞PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞衰竭)途徑的免疫耐受機制。miR-200c過度表達(dá)或SALL4沉默在恢復(fù)CD8+T細(xì)胞功能障礙和減少HBV復(fù)制方面有治療潛力。此外，miR-200c與HCC患者的存活率呈顯著正相關(guān)，而SALL4與存活率呈顯著負(fù)相關(guān)，提示miR-200c和SALL4可能成為HCC病患者生存期預(yù)測的潛在指標(biāo)。