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「輝駿客戶文章」Nature Communications| 南方醫(yī)院團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)miR-500a-5p在結(jié)直腸癌中的新機(jī)制
發(fā)布時(shí)間:2019-03-02 10:38:26作者:輝駿生物-fitgene

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背景:
結(jié)直腸癌(CRC)是全球癌癥相關(guān)性死亡的主要原因之一,復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率較高。闡明CRC發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制將有助于尋找新的診斷生物標(biāo)志物和開發(fā)有效的治療干預(yù)措施。在過去的研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些參與結(jié)直腸癌形成和發(fā)展的蛋白質(zhì)編碼基因,本研究主要針對(duì)microRNA(miRNA)在CRC中的作用進(jìn)行探討。

內(nèi)容概述:
2019年2月,南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院消化內(nèi)科重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在期刊Nature Communications上發(fā)表題為“The p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2 signalling axis regulates cell proliferation in human colorectal cancer”的文章,發(fā)現(xiàn)CRC組織中miR-500a-5p的低表達(dá)與CRC惡性發(fā)展相關(guān)。在CRC細(xì)胞中過表達(dá)miR-500a-5p可使其G0/G1期阻滯,抑制其生長(zhǎng)和遷移。從機(jī)制上講,miR-500a-5p直接結(jié)合HDAC2基因并抑制其介導(dǎo)的裸鼠大腸癌細(xì)胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子YY1與miR-500a-5p的啟動(dòng)子結(jié)合并負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄,且miR-500a-5p的水平還受到p300/YY1/HDAC2復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控。小鼠模型實(shí)驗(yàn)也表明miR-500a-5p表達(dá)可顯著抑制腫瘤的發(fā)展。該研究為結(jié)直腸癌治療提供了新的潛在候選基因。

主要技術(shù):
Co-IP、ChIP、蛋白質(zhì)譜檢測(cè)(LC-MS/MS)、雙熒光素酶分析;
輝駿生物為本研究提供了蛋白質(zhì)譜檢測(cè)和分析服務(wù)

研究路線:

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研究結(jié)果:
1. miR-500a-5p在CRC中低表達(dá),與 CRC的惡性發(fā)展有關(guān)
研究者通過miRNA微陣列分析確定了人正常結(jié)腸上皮FHC細(xì)胞和人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和LoVo中的miRNA表達(dá)譜,其中17個(gè)miRNA在2種CRC細(xì)胞中有相似的表達(dá)模式(圖1a),并從中選擇了miR-500a-5p做進(jìn)一步研究。qPCR檢測(cè)確認(rèn)miR-500a-5p在CRC細(xì)胞系及人類CRC組織中低表達(dá)(圖1b-d)。原位雜交(ISH)顯示miR-500a-5p定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中(圖1e)。此外,研究者將患者按照低表達(dá)/高表達(dá)分組,Kaplan–Meier生存曲線分析結(jié)果顯示,miR-500a-5p表達(dá)低的結(jié)腸癌患者的總體生存期較短。這些發(fā)現(xiàn)表明,miR-500a5p在CRC細(xì)胞中的低表達(dá)與CRC患者的低生存率有關(guān)。


CRC的臨床病理特征分析結(jié)果表明miR-500a-5p的低表達(dá)與CRC的惡性進(jìn)展有關(guān)。為探討miR-500a-5p的作用,分別在低表達(dá)miR-500a-5p的CRC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p模擬物,在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p抑制劑??寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和EDU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,miR-500a-5p水平升高導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制,水平降低導(dǎo)致細(xì)胞增殖加快(圖1f-i)。FACS分析、傷口愈合、transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步表明,miR-500a-5p對(duì)CRC細(xì)胞的惡性特征有抑制作用。

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2. HDAC2是miR-500a-5p的靶標(biāo)
采用4個(gè)公共的miRNA預(yù)測(cè)工具(miRanda, TargetScan, miRTP 和RNA22-HSA),并結(jié)合表達(dá)譜數(shù)據(jù)(圖2a),預(yù)測(cè)miR-500a-5p的靶基因,發(fā)現(xiàn)HDAC2可能是其潛在靶標(biāo) (圖2b)。首先,WB和qPCR檢測(cè)潛在靶基因HDAC2與miR-500a-5p水平是否有相關(guān)性,結(jié)果顯示10對(duì)癌組織和正常組織樣本中的HDAC2蛋白水平較高,而miR-500a-5p水平較低(圖2c,d);81例CRC患者組織中HDAC2的mRNA水平與miR-500a-5p水平呈負(fù)相關(guān)(圖2e)。之后,采用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來確定HDAC2是否為miR-500a-5p的直接靶標(biāo),結(jié)果顯示,miR-500a-5p模擬物與HDAC2-3? UTR共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,熒光素酶活性降低,而當(dāng)突變了3’UTR上的2個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)中的任意一個(gè)后,miR-500a-5p都不能再抑制熒光素酶活性(圖3a,b),進(jìn)一步證實(shí)了HDAC2是miR-500a-5p的靶基因。當(dāng)在CRC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p 模擬物后,HDAC2蛋白表達(dá)下調(diào),在正常人結(jié)腸上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-500a-5p抑制劑后,HDAC2蛋白表達(dá)上調(diào)(圖3c)??寺⌒纬?、WST-1和Transwell實(shí)驗(yàn)表明,HDAC2的過表達(dá)可以部分消除miR-500a-5p對(duì)細(xì)胞惡性特征的抑制作用(圖3d-f)。綜上所述,miR-500a-5p通過抑制HDAC2的表達(dá)來阻礙CRC發(fā)生和發(fā)展。
 

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3. miR-500a-5p通過靶向HDAC2在體內(nèi)抑制CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)
接下來,研究者分別將表達(dá)miR-500a-5p、m-NC、HDAC2、空載體,和同時(shí)表達(dá)miR-500a-5p/HDAC2的LoVo細(xì)胞移植到小鼠體內(nèi),建立了5種小鼠異種移植模型,評(píng)估m(xù)iR-500a-5p對(duì)體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)的影響 (圖4a)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-500a-5p組的腫瘤最小,HDAC2組的腫瘤最大,miR-500a-5p/HDAC2組的腫瘤小于HDAC2組 (圖4a,b);之后他們又檢測(cè)了五組移植瘤中細(xì)胞增殖(Ki-67)和血管生成(CD105)標(biāo)志物蛋白的表達(dá)。IHC染色結(jié)果顯示,miR-500a-5p組的增殖率和腫瘤血管密度最低,HDAC2組最高, miR-500a-5p和HDAC2的過表達(dá)部分削弱了HDAC2對(duì)生長(zhǎng)速度和腫瘤血管密度的作用(圖4c- f)。這些數(shù)據(jù)證實(shí)miR-500a-5p抑制了HDAC2介導(dǎo)的小鼠CRC細(xì)胞的生長(zhǎng)。
 

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4. miR-500a-5p受轉(zhuǎn)錄因子YY1負(fù)調(diào)控
為了確定miR-500a-5p受哪些因素調(diào)控,研究者分析了其基因上游1kb的基因組DNA序列。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果表明,該序列中含有miR-500a-5p啟動(dòng)子。以往報(bào)道證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子YY1與HDAC相互作用,因此作者研究了轉(zhuǎn)錄因子YY1能否調(diào)控CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的表達(dá)。CONSITE軟件分析顯示YY1在miR-500a-5p啟動(dòng)子上有3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)(?327~?333,?622~?628和?741~?747) (圖5a,b)。接著,將這三個(gè)位點(diǎn)序列分別構(gòu)建熒光素酶載體,使之與YY1載體或空載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè),結(jié)果表明,YY1的加入使這3個(gè)位點(diǎn)序列的啟動(dòng)子活性均降低了2.5倍以上(圖5c)。為了證實(shí)YY1能夠在體內(nèi)與miR-500a-5p啟動(dòng)子結(jié)合,作者在過表達(dá)YY1的CRC細(xì)胞中用YY1抗體進(jìn)行了ChIP-qPCR檢測(cè),確定miR-500a-5p啟動(dòng)子區(qū)域的這3個(gè)潛在結(jié)合位點(diǎn)均有顯著富集(圖5d)。


接下來,他們分析了YY1和miR-500a-5p在CRC組織中的表達(dá)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)癌組織中有更高水平的YY1(蛋白和RNA)和更低水平的miR-500a-5p (圖5e,f)。此外,CRC細(xì)胞中YY1的瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)致miR-500a-5p成熟體、前體和初始轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄都減少了(圖5g)。研究者還評(píng)估了HDAC2或YY1的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果表明,HDAC2和YY1的表達(dá)與CRC分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期顯著相關(guān)。最后,采用免疫組織化學(xué)(IHC)或原位雜交(ISH)方法檢測(cè)基因表達(dá)。結(jié)果顯示,miR-500a-5p在CRC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織,HDAC2和YY1的表達(dá)明顯高于癌旁組織。miR-500a-5p的表達(dá)與HDAC2或YY1呈負(fù)相關(guān)(圖5h)。這些結(jié)果表明,YY1下調(diào)了CRC細(xì)胞miR-500a-5p的水平,進(jìn)而影響HDAC2水平。  
 

圖5.png

5. YY1/p300/HDAC2復(fù)合體調(diào)控了CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的水平
由于組蛋白乙?;绞艿浇M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(CBP/p300, HATs)和組蛋白去乙?;?HDACs)的共同調(diào)控。以往報(bào)道指出,HDAC2和p300均可與YY1相互作用,因此研究者進(jìn)一步探討了HDAC2-p300,HDAC2-p300-YY1的作用關(guān)系。過表達(dá)和內(nèi)源性P300蛋白的Co-IP實(shí)驗(yàn)均顯示P300可以與HDAC2和YY1相互作用(圖6a,c),過表達(dá)和內(nèi)源性HDAC2蛋白的Co-IP實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果(圖6b,d),表明HDAC2-p300-YY1可能以復(fù)合物形式存在。


為了探討miR-500a-5p與YY1/p300/HDAC2復(fù)合體的關(guān)系,設(shè)置如下組別:YY1、HDAC2、p300、YY1+p300、HDAC2+p300、YY1+HDAC2+p300;轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測(cè)miR-500a-5p水平,發(fā)現(xiàn)p300可促進(jìn)miR-500a-5p轉(zhuǎn)錄,YY1或HDAC2抑制其轉(zhuǎn)錄,p300與HDAC2和/或YY1的組合也抑制其轉(zhuǎn)錄(圖6e),表明YY1或HDAC2對(duì)p300有拮抗作用。之后以上7組載體分別與miR-500a-5p啟動(dòng)子的熒光素酶載體共轉(zhuǎn)染細(xì)胞,檢測(cè)miR-500a-5p啟動(dòng)的雙熒光素酶活性,進(jìn)一步確定了p30的促進(jìn)作用,及其YY1或HDAC2的抑制作用(圖6f)。ChIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)YY1和miR-500a-5p啟動(dòng)子三個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合程度受YY1自身水平,以及HDAC2和p300水平影響。YY1、HDAC2的過表達(dá)增加了YY1與miR-500a-5p啟動(dòng)子3個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合,而p300的過表達(dá)減少了YY1與這3個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合(圖6g);當(dāng)干擾YY1、HDAC2和p300時(shí),結(jié)果剛好相反(圖6h)。此外,p300的過表達(dá)則削弱了HDAC2與3個(gè)YY1結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。這些結(jié)果表明,YY1/p300/HDAC2復(fù)合體調(diào)控了CRC細(xì)胞中miR-500a-5p的水平。
 

圖6.png

6. miR-500a-5p能夠抑制異種移植瘤和FK228治療的CRC腫瘤發(fā)展
為了研究miR-500a-5p在結(jié)直腸癌中的作用分子機(jī)制,研究者檢測(cè)了miR-500a-5p對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,確定miR-500a-5P能誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡。當(dāng)miR-500a-5p與HDAC抑制劑FK228共同作用時(shí),細(xì)胞凋亡率要顯著高于單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-500a-5p的組別(圖7a)。這些結(jié)果表明miR-500a-5p可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,并增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)FK228誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。為了探討miR-500a-5p對(duì)CRC的治療潛力,研究者建立了異種移植小鼠模型和FK228處理的CRC模型。結(jié)果顯示,移植LoVo細(xì)胞39天后,miR-500a-5p和miR-500a-5p+FK228組小鼠的腫瘤體積明顯小于m-NC組(圖7c,d)。TUNEL染色顯示,miR-500a -5P+FK228組的腫瘤細(xì)胞凋亡率最高(圖7e)。這些發(fā)現(xiàn)提示miR-500a-5p增強(qiáng)了癌細(xì)胞對(duì)HDAC抑制劑FK228誘導(dǎo)的凋亡的敏感性。以上結(jié)果表明,miR-500a-5p具有腫瘤抑制作用,具有治療CRC的潛力。

圖7.png


結(jié)論:
本研究確定miR-500a-5p在結(jié)直腸癌組織中下調(diào),miR-500a-5p水平受到Y(jié)Y1/p300/HDAC2轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的協(xié)同調(diào)控。此外,miR-500a-5p還通過直接結(jié)合HDAC2的3’UTR來抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和遷移。

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