原則：      

在典型的染色質(zhì)免疫沉淀 (ChIP)反應(yīng)中，目標(biāo)蛋白和 DNA 的交聯(lián)是通過向生長的細(xì)胞中添加甲醛來進(jìn)行的，染色質(zhì)的制備、超聲剪切和預(yù)清除以減少非特異性免疫沉淀。使用特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀。 從蛋白質(zhì) A 或蛋白質(zhì) G 瓊脂糖樹脂中洗脫蛋白質(zhì)-DNA 復(fù)合物后，加熱樣品以逆轉(zhuǎn)共價(jià)交聯(lián)。 DNA 片段通過 PCR 或?qū)崟r(shí) PCR 進(jìn)行純化和分析。

緩沖器：      

細(xì)胞裂解緩沖液：

• ? 0.1M Tris-HCl

• ? 85mM 氯化鉀

• ? 0.5% NP-40

• ? *1mM PMSF

• ? *0.01mg/ml 抑肽酶

• ? *0.01mg/ml 亮肽素

注意：標(biāo)有 * 的成分應(yīng)在每次使用前添加。

核裂解緩沖液：

• ? 50mM Tris-HCl

• ? 10mM EDTA

• ? 1% SDS

• ? *1mM PMSF

• ? *0.01mg/ml 抑肽酶

• ? *0.01mg/ml 亮肽素

注意：標(biāo)有 * 的成分應(yīng)在每次使用前添加。

透析緩沖液：

• ? 2 mM EDTA

• ? 50 mM Tris-Cl pH=8.0

• ? 0.2 % Sarkosyl（僅用于多克隆抗體）

IP 洗滌緩沖液：

• ? 100 mM Tris-Cl pH=9.0（單克隆抗體為 8.0）

• ? 500 毫米氯化鋰

• ? 1% NP-40

• ? 1% 脫氧膽酸

洗脫緩沖液

• ? 50 mM NaHCO ₃

• ? 1% SDS

協(xié)議：

第一天

1. 在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入 37% 甲醛（原液）至終濃度為 1%，然后在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上在室溫下緩慢搖動(dòng)細(xì)胞 10 分鐘。

2. 加入 100 μl 1.375 M 甘氨酸/ml 培養(yǎng)基淬滅交聯(lián)

3. 加入甘氨酸至終濃度為 0.125M，停止交聯(lián)反應(yīng)，并在室溫下繼續(xù)振蕩 5 分鐘。

4. 適當(dāng)去除培養(yǎng)基。 用預(yù)冷的 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，然后用 PBS 將細(xì)胞刮入 15ml 錐形管中。 在 4°C 下以 2,000 rpm 離心 2 分鐘。

5. 用 10 ml 細(xì)胞裂解緩沖液（冷）重懸沉淀并在冰上孵育 10 分鐘。

6. 4°C 5,000 rpm 離心 5 分鐘。 小心地用吸管丟棄上清液。

7. 用 1 ml 細(xì)胞核裂解緩沖液（冷凍）重懸沉淀并在冰上孵育 10 分鐘。

8. 繼續(xù)進(jìn)行超聲處理，同時(shí)將樣品保持在冰上。 我們使用 15 秒脈沖的超聲處理?xiàng)l件，然后是 1 分鐘的休息間隔，總超聲處理時(shí)間為 5 分鐘。 脈沖的時(shí)間和數(shù)量將根據(jù)超聲波儀、細(xì)胞類型和交聯(lián)程度而有所不同。 理想情況下，DNA 片段的大小應(yīng)為 300-1000 bp。

9. 將染色質(zhì)轉(zhuǎn)移到 1.5ml 試管中，并在 14,000 4 °C 下離心 10 分鐘或在 -80°C 下冷凍以備后用。

10. 小心地將上清液轉(zhuǎn)移到新管中。

11. 預(yù)清除染色質(zhì)（兩種方式）：

一個(gè)。  向染色質(zhì)中加入 50 μl 蛋白 A/G-瓊脂糖珠/鮭魚精子 DNA，并在 4°C 下旋轉(zhuǎn) 1 小時(shí)。

灣。 加入 10-15μl 封閉的 Sapha A 細(xì)胞，7個(gè)并在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上孵育 15 分鐘，4 °C。

12. 在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度將染色質(zhì)離心 5 分鐘。 將上清液轉(zhuǎn)移到清潔管中。 注意：等分樣品進(jìn)行控制。 （陰性和模擬）樣品體積最好為 200- 500μl。

13. 向染色質(zhì)樣品中加入特異性抗體，并在 4°C 下旋轉(zhuǎn)過夜。

第 2 天

14. 如果您使用的是來自兔以外物種的單克隆抗體或多克隆抗體，請(qǐng)加入 1μg 特異性二抗，在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上孵育 1 小時(shí)。

15. 對(duì)應(yīng)步驟11：

一個(gè)。  在冰上的染色質(zhì)樣品中加入 50 μl 蛋白 A/G-瓊脂糖珠/鮭魚精子 DNA 珠。  在 4°C 下旋轉(zhuǎn) 2 小時(shí)。

灣。  向每個(gè)樣品中加入 10 μl 封閉的 Staph A 細(xì)胞。  在室溫下在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上孵育 15 分鐘。

16. 在 4°C 下以 14,000 rpm 的速度將樣品離心 2 分鐘。

17. 從 IgG 樣品的上清液中取出 15 μl 作為“輸入”以備后用。

18. 小心棄去所有樣品的上清液。

19. 用 1 ml 透析緩沖液洗滌沉淀兩次，用 IP 洗滌緩沖液洗滌 4 次。 每次洗滌時(shí)，將樣品在旋轉(zhuǎn)平臺(tái)上孵育 3 分鐘，然后離心 1 分鐘，小心棄去上清液。 高效洗滌對(duì)于降低背景至關(guān)重要。

20. 通過加入 50 μl IP 洗脫緩沖液在 RT 和設(shè)置 3 渦旋 15 分鐘洗脫抗體/蛋白質(zhì)/DNA 復(fù)合物。

21 . 在室溫下以 14,000 rpm 離心 3 分鐘，然后將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

22. 重復(fù)步驟 20-21 一次

25. 以 14,000 rpm 離心樣品 5 分鐘以去除瓊脂糖珠或葡萄球菌 A 細(xì)胞。 將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

26. 加入 1 ul 高濃度 RNase A (10 mg/ml) 和 5M NaCl 至終濃度為 0.3 M。將樣品在 67°C 水浴中孵育 4-5 小時(shí)以逆轉(zhuǎn)甲醛交聯(lián)。

27. 加入 2 倍半體積的乙醇并在 -20°C 下沉淀過夜。

第 3 天

28. 在 4°C 下以 14,000 rpm 離心樣品 15-20 分鐘。 去除殘留的乙醇，讓顆粒完全風(fēng)干。

29 . 將每個(gè)顆粒溶解在 100 ul TE 緩沖液中，然后進(jìn)行 PCR 檢測(cè) 和 瓊脂糖凝膠電泳 。

輝駿生物使用ChIP-qPCR、ChIP-seq等技術(shù)在染色質(zhì)免疫共沉淀ChIP研究實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)超10年，公司在DNA與蛋白相互作用研究方面經(jīng)驗(yàn)豐富，自有實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地，ChIP外包代作服務(wù)價(jià)格優(yōu)惠，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)已協(xié)助發(fā)表上千位客戶發(fā)表高分論文。

輝駿生物提供的ChIP染色質(zhì)免疫共沉淀服務(wù)分為以下兩種：

1. ChIP qPCR，用于檢測(cè)某樣本中的誘餌蛋白和待測(cè)DNA片段是否結(jié)合；

2. ChIP seq，用于篩選某樣本中的誘餌蛋白可以結(jié)合哪些DNA區(qū)域。

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