蛋白質(zhì)鑒定方法

蛋白質(zhì)鑒定這里的是指利用一定的生化和物理方法對蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的篩選和鑒定。 傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)鑒定方法，包括免疫印跡、已知或未知蛋白質(zhì)的復(fù)合分析以及內(nèi)肽的化學(xué)測序，都復(fù)雜、耗時且準(zhǔn)確度較低。

蛋白質(zhì)鑒定方法已經(jīng)從圖像分析技術(shù)、微量測序、氨基酸組成分析發(fā)展到質(zhì)譜分析。  圖像分析技術(shù)使用光譜儀。  整個過程涉及到一些斑點的檢測、背景扣除、斑點匹配和數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。  圖像分析和氨基酸組成分析需要結(jié)合其他蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)來完成整個過程。  微測序技術(shù)更新迅速，實現(xiàn)了蛋白質(zhì)自動識別的目標(biāo)。   如今，研究人員越來越傾向于選擇質(zhì)譜相關(guān)技術(shù)進(jìn)行快速蛋白質(zhì)鑒定。

質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的不同方法

質(zhì)譜儀可以將肽指紋和肽片段的測序結(jié)果與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的理論肽質(zhì)量指紋（PMF）進(jìn)行比較，以尋找最佳候選蛋白質(zhì)。  與質(zhì)譜相關(guān)的蛋白質(zhì)鑒定方法包括基于 MALDI-TOF 的蛋白質(zhì)指紋識別和基于 LC-MS/MS 的肽測序。

• MALDI-TOF / MS

(1) MALDI-TOF/MS的原理

MALDI-TOF 是一種基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜儀。  基于 MALDI-TOF 的蛋白質(zhì)指紋圖譜法用于用某種蛋白水解酶（通常是胰蛋白酶）消化樣品并獲得 MS 譜，從而生成所有肽（或 MH+）的質(zhì)量。   這些質(zhì)量用作指紋以在數(shù)據(jù)庫中搜索蛋白質(zhì)并匹配測量的質(zhì)量。  與最高分匹配的蛋白質(zhì)為候選蛋白質(zhì)。

圖 1. MALDI-TOF 質(zhì)譜分析過程

(2) MALDI-TOF/MS的優(yōu)勢

MALDI-TOF/MS 的優(yōu)勢在于高精度的離子反射器和延遲離子提取，這使得它可以快速收集 MALDI-TOF/MS 數(shù)據(jù)并分析結(jié)果。

(3) MALDI-TOF/MS的應(yīng)用

主要用于臨床醫(yī)學(xué)、食品工業(yè)和動植物檢疫中微生物的鑒定和分類。

• 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜

(1) LC-MS/MS的原理

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)可以通過分析物質(zhì)的分子量和元素組成來研究分子結(jié)構(gòu)等信息。  在通過 LC-MS/MS 肽測序鑒定蛋白質(zhì)期間，蛋白水解消化（通常是胰蛋白酶消化）中的肽混合物通過 HPLC 進(jìn)行分離。  串聯(lián)質(zhì)譜儀和 HPLC 用于進(jìn)行肽片段化。  獲得每個碎片肽段的 MS/MS 譜圖（通常每個樣品有數(shù)千個 MS/MS 譜圖）。  每個 MS/MS 譜圖（對應(yīng)于特定的肽段序列）用于搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中的匹配肽段，以最終識別蛋白質(zhì)。   尤其是反相液相色譜和串聯(lián)質(zhì)譜（串聯(lián)質(zhì)譜）的結(jié)合，可以在幾十皮摩爾的水平上進(jìn)行檢測。   如果毛細(xì)管色譜與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合，可以檢測到低濃度、低于飛摩爾水平和原子水平的蛋白質(zhì)。   目前，蛋白質(zhì)的鑒定多采用酶水解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜和計算機(jī)算法相結(jié)合的方法。

圖 2. 與液相色譜 (LC-MS/MS) 相關(guān)的串聯(lián)質(zhì)譜圖

(2) LC-MS/MS的優(yōu)勢

LC-MS/MS 可以以高靈敏度和特異性分析中小極性分子。

(3) LC-MS/MS的應(yīng)用

LC-MS/MS 可以確定蛋白質(zhì)分子量，分析肽段和蛋白質(zhì)修飾位點，并鑒定蛋白質(zhì)。  可用于生物化學(xué)、農(nóng)業(yè)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。

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