制備帶標(biāo)記的RNA探針是RNA pull down實(shí)驗中最開始、也是最關(guān)鍵的步驟。

首先確定目標(biāo)序列。根據(jù)實(shí)驗?zāi)康拇_定合適的RNA序列，可以是目標(biāo)轉(zhuǎn)錄本的全部序列或部分序列；對照組通常采用反義序列，也可以是無關(guān)序列。如果目標(biāo)序列小于100bp，建議直接合成帶標(biāo)記的RNA，如果大于100bp，可以按照如下步驟體外轉(zhuǎn)錄獲得。

1. 制備帶有T7啟動子和目標(biāo)序列的DNA模板。通過PCR或全基因合成方法獲得目標(biāo)序列，例如測序驗證過的純化PCR產(chǎn)物或質(zhì)粒。以此為模板，設(shè)計帶有T7啟動子（TAATACGACTCACTATAGGG）的引物，PCR分別獲得T7-正義鏈（實(shí)驗組）和T7-反義鏈（對照組）DNA模板并回收純化。

2. 體外轉(zhuǎn)錄得到標(biāo)記的RNA探針。以帶有T7啟動子的DNA為模板，采用體外轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，生成RNA。為了進(jìn)行后續(xù)RNA pull down實(shí)驗，同時對RNA進(jìn)行標(biāo)記。

RNA pull down實(shí)驗常常采用生物素標(biāo)記目標(biāo)RNA，基于生物素與鏈霉親和素之間的強(qiáng)大親和力，用鏈霉親和素磁珠捕獲RNA探針的互作復(fù)合體。

生物素標(biāo)記RNA的常見做法是在轉(zhuǎn)錄體系中加入生物素標(biāo)記的UTP，邊轉(zhuǎn)錄邊標(biāo)記，但標(biāo)記效率會隨著序列的長度增加而逐漸下降，因此不同RNA序列獲得的探針量不穩(wěn)定。標(biāo)記好的生物素RNA還需要純化以去除游離的生物素UTP，純化過程中也會有一些RNA損失。

為解決RNA探針標(biāo)記的難題，輝駿生物研發(fā)了一種新的標(biāo)記方法，利用一段只有16nt的RNA標(biāo)簽“F2”來標(biāo)記RNA。磁珠上偶聯(lián)的特異性配體與F2標(biāo)簽具有強(qiáng)大的親和力，可以高效調(diào)取目標(biāo)RNA。該方法的最大優(yōu)勢是：在構(gòu)建DNA模板時即可以將F2與目標(biāo)序列連接，省去了轉(zhuǎn)錄時的標(biāo)記步驟，實(shí)現(xiàn)了100%標(biāo)記，不僅可以標(biāo)記線性RNA，還可以標(biāo)記環(huán)狀RNA（circRNA），并能靈活的進(jìn)行體內(nèi)、體外標(biāo)記。除此之外，省去了標(biāo)記后的RNA純化步驟，避免了RNA損失、操作更加簡單，降低了成本。目前該方法已經(jīng)獲得國家專利授權(quán)。

F2 RNA pull-down試劑盒使用案例

左：RNA pull down WB檢測圖（陽性）；    右：RNA pull down MS產(chǎn)物銀染圖

F2-RNA pull down試劑盒產(chǎn)品信息-輝駿生物

RNA pull down實(shí)驗—輝駿服務(wù)內(nèi)容

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