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客戶文章技術(shù)專題問題答疑
互作實(shí)驗(yàn)蛋白實(shí)驗(yàn)分子細(xì)胞實(shí)驗(yàn)
GST融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)問題及解決方法

Q1:目的蛋白結(jié)合效率低或不結(jié)合怎么辦?

可能原因1:蛋白序列出現(xiàn)移碼等錯(cuò)誤

解決辦法1:測序確認(rèn),調(diào)整閱讀框以獲得GST.Tag融合表達(dá)蛋白;選擇適宜的宿主菌,如蛋白酶缺陷型大腸桿菌,稀有密碼子宿主菌Rosetta系列。


可能原因2:融合蛋白可能改變了GST 的構(gòu)象,因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力。

解決辦法2:檢測所使用的pGEX 載體中GST的結(jié)合。準(zhǔn)備帶有所使用的pGEX的細(xì)胞超聲裂解物,檢測其與層析柱的結(jié)合。如果結(jié)合的很好,則可能是標(biāo)簽蛋白改變了GST 的構(gòu)象,因此降低了GST 標(biāo)簽蛋白的親和力??梢酝ㄟ^降低結(jié)合的溫度到4°C限制洗滌來改善結(jié)果。


可能原因3:GST 融合蛋白發(fā)生聚集沉淀

解決辦法3:在裂解buffer和其他緩沖體系中加入DTT,經(jīng)驗(yàn)告知,1-20mM的DTT 會顯著增加某些GST融合蛋白的結(jié)合。


可能原因4:GST融合蛋白被過度稀釋

解決辦法4:重新濃縮樣品,增加蛋白濃度。


可能原因5:GST 融合蛋白被機(jī)械裂解的方法變性(比如超聲)

解決辦法5:過度超聲產(chǎn)熱會破壞標(biāo)簽蛋白,建議采用超高壓破碎。


可能原因6:結(jié)合緩沖條件不適宜

解決辦法6:低于pH6.5或高于pH8時(shí),融合蛋白與層析柱結(jié)合不充分導(dǎo)致結(jié)合效率低,請確認(rèn)磁珠在用于目的蛋白純化前經(jīng)過pH6.5~8.0緩沖液充分的平衡。


可能原因7:層析柱使用次數(shù)過多,雜質(zhì)干擾

解決辦法7:層析柱再生或使用新的層析柱。


Q2:目的蛋白洗脫不下來或洗脫率低是什么原因?qū)е碌模?/span>

可能原因1:洗脫緩沖液的體積太少

解決辦法1:增加洗脫緩沖液的體積。


可能原因2:洗脫緩沖液的pH過低

解決辦法2:調(diào)節(jié)洗脫緩沖液pH值至8-9 。


可能原因3:洗脫的時(shí)間不夠

解決辦法3:增加洗脫緩沖液與磁珠反應(yīng)的時(shí)間。


可能原因4:洗脫緩沖液中谷胱甘肽濃度太低

解決辦法4:增加洗脫緩沖液中谷胱甘肽的濃度。


可能原因5:洗脫緩沖液中谷胱甘肽失效被氧化

解決辦法5:洗脫緩沖液現(xiàn)配現(xiàn)用。

可能原因6:洗脫緩沖液的離子強(qiáng)度過低

解決辦法6:增加洗脫緩沖液中的離子強(qiáng)度,在洗脫緩沖液中加入0.1~0.2M的氯化鈉也會改善洗脫效果。


Q3:洗脫的蛋白中為什么含有雜質(zhì)?

可能原因1:在宿主細(xì)菌中蛋白被降解

解決辦法1:使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT,或ompT和lon雙缺陷型菌株。

可能原因2:GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

解決辦法2:加入蛋白酶抑制劑PMSF。注:絲氨酸蛋白酶抑制劑必須在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。


可能原因3:細(xì)胞破碎時(shí)超聲處理過度

解決辦法3:降低裂解時(shí)間,機(jī)械裂解前加入溶菌酶(0.1 倍體積的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能會使結(jié)果變好。避免發(fā)泡,因?yàn)檫@可能使標(biāo)簽蛋白變性。過分裂解也會導(dǎo)致宿主細(xì)胞蛋白和GST 標(biāo)簽蛋白共純化。


可能原因4:分子伴侶或許被共純化了

解決辦法4:多余的條帶可能由于共純化一些分子伴侶所造成。這些分子伴侶參與大腸桿菌中新生成的蛋白的正確折疊。如:DnaK(分子量70 000)、DnaJ(分子量37 000)、GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)、GroES(分子量10 000 )。一些從這些共純化的蛋白中分離GST融合蛋白的方法已經(jīng)發(fā)表。


Q4:如何解決目的蛋白酶切后電泳檢測發(fā)現(xiàn)多條條帶?

可能原因:蛋白酶切發(fā)生在宿主細(xì)菌內(nèi)

解決辦法:檢測條帶何時(shí)出現(xiàn):如果確定多余的條帶在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在,這些條帶可能是在宿主細(xì)菌中被降解的結(jié)果。目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位點(diǎn),請檢查序列。




輝駿生物提供的GST Pull down實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)分為以下兩種:

1. GST Pull down WB,用于體外檢測誘餌蛋白與某樣本中的待測蛋白是否存在相互作用;

2. GST Pull down MS,用于體外篩選誘餌蛋白與某樣本中的哪些蛋白具有相互作用。


GST pull down檢測服務(wù)

服務(wù)項(xiàng)目服務(wù)內(nèi)容結(jié)果交付實(shí)驗(yàn)周期  
客戶提供價(jià)格
GST pull down WB構(gòu)建誘餌蛋白的GST原核表達(dá)載體(可選做)載體質(zhì)粒、甘油菌、測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告約2周        

1、含有誘餌基因序列的質(zhì)粒模板及測序文件

2、實(shí)驗(yàn)樣本

3、待測蛋白抗體

4、實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息、誘餌蛋白和待測蛋白序列)

點(diǎn)擊詢價(jià)



原核表達(dá)誘餌蛋白并進(jìn)行Western blot檢測Western blot檢測圖4-5周
Western blot檢測待測樣本中的獵物蛋白Western blot檢測圖

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(2組:實(shí)驗(yàn)組、空載對照組)
pull down實(shí)驗(yàn)報(bào)告
Western blot檢測Pull down產(chǎn)物中的誘餌蛋白和待測蛋白Western blot檢測圖
GST pull down  MS       
構(gòu)建誘餌蛋白的GST原核表達(dá)載體(可選做)

載體質(zhì)粒、甘油菌、測序結(jié)果和實(shí)驗(yàn)報(bào)告

約2周      

1、含有誘餌基因序列的質(zhì)粒模板及測序文件

2、實(shí)驗(yàn)樣本

3、實(shí)驗(yàn)信息表(樣本信息、誘餌蛋白序列)

點(diǎn)擊詢價(jià)

原核表達(dá)誘餌蛋白并進(jìn)行Western blot檢測Western blot檢測圖

GST pull down捕獲誘餌蛋白及其互作蛋白

(3組:實(shí)驗(yàn)組、空載對照組、裂解液對照組)
pull down實(shí)驗(yàn)報(bào)告
Western blot檢測pull down產(chǎn)物中的誘餌蛋白Western blot檢測圖
LC-MS/MS定性檢測pull down產(chǎn)物的蛋白、篩選實(shí)驗(yàn)組獨(dú)有蛋白(潛在互作蛋白)質(zhì)譜檢索表格、互作蛋白篩選表格、檢測報(bào)告
針對互作蛋白做生物信息學(xué)分析(GO、KEGG pathway、String)生物信息學(xué)分析結(jié)果和報(bào)告1周



GST pull down技術(shù)服務(wù)優(yōu)勢*輝駿生物

1
近十年服務(wù)經(jīng)驗(yàn),眾多服務(wù)案例,服務(wù)成果得到優(yōu)秀期刊認(rèn)可
2
對蛋白互作的篩選鑒定理解深刻,擅長針對客戶情況提出合適的方案建議
3
自有分子及細(xì)胞生物實(shí)驗(yàn)平臺,能有效制定并執(zhí)行最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)路線
4
自有蛋白質(zhì)組學(xué)平臺,對微量互作蛋白的質(zhì)譜鑒定有十足的把控能力,對后續(xù)的生物信息分析有獨(dú)到的見解
5
售后技術(shù)支持將一直保持到客戶發(fā)表文章,確保客戶安心進(jìn)行下游實(shí)驗(yàn)及投稿



GST融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)結(jié)果示例

GST pull down試驗(yàn)服務(wù)結(jié)果分析

GST pull down WB:Western blot檢測圖(陽性)


GST-pull down外包實(shí)驗(yàn)服務(wù)結(jié)果分析

GST Pull-down MS:Western blot檢測圖


GST pull down實(shí)驗(yàn)服務(wù)費(fèi)用價(jià)格實(shí)惠質(zhì)量高

GST pulldown MS:質(zhì)譜檢索表格(部分展示)




GST融合蛋白純化實(shí)驗(yàn)服務(wù)-輝駿生物客戶文章


1. Chen S.L. et al: A GYS2/p53 Negative Feedback Loop Restricts Tumor Growth in HBV-Related Hepatocellular Carcinoma. Cancer Research.  2019,IF=9.727.
【研究內(nèi)容】:前期研究表明,GYS2基因在HCC患者低表達(dá),干擾GYS2基因表達(dá)導(dǎo)致腫瘤增殖轉(zhuǎn)移。本研究通過融合表達(dá)GST-GYS2、His-p53、His-MDM2,并用GST-pull down方法,證實(shí)了MDM2與p53競爭性結(jié)合GYS2基因。相關(guān)的COIP、ChIP-qPCR等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明GYS2基因降低腫瘤增殖轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
使用相關(guān)技術(shù): gst pulldown測定、GST-pull down質(zhì)譜分析、GST標(biāo)簽蛋白


2. Jiang L. et al: Bach1 Represses Wnt/β-Catenin Signaling and Angiogenesis. Circ Res. 2015,IF=14.467.
【研究內(nèi)容】:Wnt/β-catenin信號在內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成活性中起重要作用。過表達(dá)實(shí)驗(yàn)表明,轉(zhuǎn)錄因子Bach1過表達(dá)可抑制后肢缺血小鼠的血管生成,并抑制Wnt3a刺激的血管生成反應(yīng)和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞Wnt/β-catenin靶基因的表達(dá)。Co-IP實(shí)驗(yàn)和gst pull-down分析表明,Bach1直接與TCF4結(jié)合,并減少β-catenin與TCF4的相互作用。研究揭示了Bach1抑制外周缺血損傷后的血管生成的作用機(jī)制,為血管生成治療或其他涉及Wnt/β-catenin通路異常調(diào)節(jié)的疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。
使用相關(guān)技術(shù): GST 融合蛋白、GST pull-down實(shí)驗(yàn)、GST pull-down技術(shù)



標(biāo)簽:circRNA  circRNA翻譯蛋白  翻譯蛋白  mRNA  

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