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Q：收到細胞后，傳代、凍存后復蘇過幾次都沒什么問題，最近因?qū)嶒炇曳跸湮廴?，清潔消毒細胞室后，重新復蘇，結(jié)果連續(xù)復蘇6支，細胞均未貼壁，今晚復蘇6小時后觀察有一瓶相對貼壁細胞數(shù)較之前復蘇失敗瓶多，但貼壁細胞狀態(tài)不好，形態(tài)不佳，透光度亦不好！到底是哪里出了問題呢？

A：首先，復蘇過程沒有問題，是否是從液氮拿出直接放入溫水，還有培養(yǎng)箱，二氧化碳濃度，培養(yǎng)基、PH值等環(huán)節(jié)。要么加高濃度FBS 15-20%，看看能否幫助貼壁，當然也需要考慮血清問題，還有確信拿來的細胞沒問題。

其次，應該懷疑凍存，實際上復蘇出問題的可能非常小，因為操作簡單，而且死板，下面這些原因需要逐個排查：

1、凍存的時候是不是消化的時間過長，這是一般人所注意不到的，即使書上也不講這個問題，但我因為這個問題就兩種肺癌細胞和一種肝癌細胞專門做過試驗，這個絕對是絕大部分人細胞復不活的一個原因。太長的消化時間會讓細胞復蘇時失去貼壁能力，表現(xiàn)為先貼后死，原因是在你復蘇的時候細胞已進入凋亡程序，不可逆轉(zhuǎn)的死亡。
2、凍存液好不好，是什么，甘油還是DMSO，質(zhì)量非常重要，否則也會死亡。
3、凍存液的量加的是不是太多，ATCC推薦是不超過7%，大于5%，太多也不好。
4、在凍存的時候是不是把DMSO混均勻，這個有一些影響，但不算太大。
5、凍存是否按部就班，就是所溫度梯度是不是把握嚴格，很多人容易忘卻這個事情，因為這個東西流程長。
6、如果細胞污染，是否能很快看到。從這個角度講建議去除離心這步。
7、細胞在凍存前是否過密。
　　

還有，不贊成孵箱污染這個概念的，所有在一個孵箱里的細胞都污染一個細菌的話，這個細菌是源于孵箱的，但這不代表孵箱污染，因為孵箱無論你如何處理都有大量的細菌，問題在操作。細胞房不換拖鞋，非常臟，別人的細胞都污染，很多細胞都污染到絕種，但只污染一次（兩年內(nèi)只有兩瓶），哪次是因為別人動了，每次細胞擺放順序都是記住的。如果懷疑孵箱污染，那說明在養(yǎng)細胞這方面很差。

每次污染的原因都要盡可能的找，以后就不犯同樣的問題，這個很重要，不能靠猜，否則就有可能細胞養(yǎng)絕最后換課題。