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中文標題：LncRNA ILF3-AS1通過抑制海馬miR-212的表達介導癲癇的發(fā)生

發(fā)表期刊：Aging-US

影響因子：4.831

發(fā)表時間：2020年7月

合作單位：中山大學附屬第六醫(yī)院神經內科

運用技術：載體構建（由輝駿生物提供技術支持）

● 研究背景

癲癇是由神經元異常興奮引起的神經系統(tǒng)疾病。癲癇持續(xù)狀態(tài)會對神經系統(tǒng)和海馬神經元造成持續(xù)性和急性損害。這些刺激可以誘導細胞釋放興奮性氨基酸，導致Ca2+和Na+內流，進而損傷神經元，導致神經元凋亡、纖維發(fā)芽、膠質細胞增殖、海馬神經元丟失和海馬硬化等。顳葉癲癇(TLE)是最常見的疾病之一，近年來盡管取得了一些治療進展，但其潛在機制仍不清楚。有證據(jù)表明，基質金屬蛋白酶(MMP)表達或活性的增加可促進癲癇的發(fā)生，也有人認為MMP抑制劑可能是治療癲癇的一種有效方法，但現(xiàn)有的MMP抑制劑缺乏特異性，且副作用嚴重。MMP上游的分子可能比MMP本身更適合靶向治療。

長非編碼RNA(LncRNA)是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA。多項研究表明，lncRNA在多種疾病的進展和發(fā)病機制中起關鍵作用，包括心血管疾病、椎間盤退變、神經退行性疾病和癌癥。LncRNA還被發(fā)現(xiàn)參與許多生物學過程，包括細胞發(fā)育、凋亡、干細胞分化、遷移和炎癥等。在結腸癌、骨肉瘤、宮頸癌和黑色素瘤等幾種癌癥中均已經檢測到一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA ILF3-AS1的異常表達。此外，H19和RNA-UCA1這兩個lncRNA，近來被證明與癲癇的發(fā)生有關。因此，本研究旨在研究ILF3-AS1在TLE患者中的表達是否發(fā)生改變，并評估ILF3-AS1與MMP之間的關系。

● 研究結果

1.     ILF3-AS1在TLE患者的海馬區(qū)中過表達

在這項研究中，41名受試者被分為TLE組（23人）和對照組（18人）兩組，研究者首先分析了兩組患者海馬區(qū)中ILF3-AS1的表達。如圖1A所示，TLE組海馬區(qū)ILF3-AS1表達高于對照組。此外，TLE組血清ILF3-AS1水平也高于對照組（圖1B）。

圖1

2. ILF3-AS1與炎性細胞因子表達的關系

為探討炎性細胞因子對TLE中ILF3-AS1表達的影響，用IL-1β或TNF-α處理星形膠質細胞。結果表明，IL-1β和TNF-α均能誘導星形膠質細胞中ILF3-AS1的表達(圖2A和2B)。為了進一步探討ILF3-AS1與炎性細胞因子在TLE中的關系，研究者將pcDNA-ILF3-AS1質粒轉染星形膠質細胞，導致ILF3-AS1在轉染細胞中過表達(圖3A)。值得注意的是，這種異位表達還促進了星形膠質細胞中IL-1β(圖3B)、IL-6(圖3C)和TNF-α(圖3D)的表達。

圖2

圖3

3. ILF3-AS1過表達促進MMP2、MMP3、MMP9和MMP14的表達

由于炎性細胞因子刺激后TLE中MMP2、MMP3、MMP9和MMP14的表達增強，研究者進一步研究了這些基因的表達是否受ILF3-AS1的調節(jié)。結果顯示，在異位過度表達ILF3-AS1的星形膠質細胞中，MMP2(圖4A)、MMP3(圖4B)、MMP9(圖4C)和MMP14(圖4D)的表達均有上調。

圖4

4. ILF3-AS1靶向TLE患者星形膠質細胞和海馬區(qū)的miR-212

為了研究ILF3AS1可能促進TLE進展的分子機制，研究者用Starbase分析了其相互作用組，預測結果顯示ILF3-AS1可能與miR-212結合(圖5A)。此外，用miR-212模擬物處理的星形膠質細胞中miR-212的表達增加(圖5B)。熒光素酶報告基因分析結果顯示，在轉染野生型ILF3-AS1報告質粒的星形膠質細胞中，miR-212過表達降低了熒光素酶活性(圖5C)。相反，強制表達ILF3-AS1抑制了細胞中miR-212的表達(圖5D)。與這些發(fā)現(xiàn)一致的是，TLE患者的海馬區(qū)和血清的miR-212水平均低于對照組(圖6A和6B)。

圖5

圖6

5. ILF3-AS1通過靶向miR-212誘導炎性細胞因子MMP3和MMP9的表達

為確定ILF3-AS1是否通過抑制miR-212促進炎性細胞因子和MMP的表達，研究者進行了一系列挽救實驗。在過度表達IL-1AS1的星形膠質細胞中，強制表達miR212降低了IL-1β(圖7A)、IL-6(圖7B)和TNF-α(圖7C)的表達。同樣，在ILF3-AS1過表達的細胞中，miR-212的高表達降低了MMP3(圖7D)和MMP9(圖7E)的表達。

 圖7