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中文標(biāo)題：FEN1促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌腫瘤進(jìn)展并增強(qiáng)順鉑耐藥性

發(fā)表期刊：Molecular Oncology

影響因子：5.314

發(fā)表時(shí)間：2017年2月

合作單位：南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院

運(yùn)用技術(shù)：慢病毒包裝（由輝駿生物提供技術(shù)支持）

● 研究背景

肺癌是全球男性和女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌病例的85%。如今在臨床治療中，大多數(shù)抗癌劑通過干擾DNA復(fù)制或誘導(dǎo)DNA損傷的方式來殺死細(xì)胞，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在這些抗癌藥物中，順鉑代表了癌癥臨床治療史上一個(gè)成功的里程碑。然而，由于癌細(xì)胞中高效的DNA復(fù)制和修復(fù)系統(tǒng)，順鉑的療效并不充分，耐藥機(jī)制也有待于進(jìn)一步研究。

以往的報(bào)道表明，癌癥對(duì)DNA損傷誘導(dǎo)劑的耐藥性與癌細(xì)胞中DNA修復(fù)酶的表達(dá)升高有關(guān)。DNA翻蓋內(nèi)切酶1(FEN1)是DNA修復(fù)途徑中的關(guān)鍵分子，鑒于順鉑誘導(dǎo)的DNA加合物鏈內(nèi)交聯(lián)主要由NER修復(fù)，我們推測(cè)抑制FEN1表達(dá)或抑制FEN1活性可能增強(qiáng)順鉑的治療效果。鑒于FEN1在DNA復(fù)制中的作用，推測(cè)FEN1可能是肺癌細(xì)胞增殖所必需的。FEN1參與了NER和其他DNA修復(fù)途徑，說明靶向FEN1可能是克服肺癌對(duì)順鉑耐藥性的潛在途徑。FEN1抑制劑或可單獨(dú)作為阻斷癌細(xì)胞增殖的藥物，或者與DNA損傷誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用，以提高治療效果。

● 研究結(jié)果

1.     FEN1在肺癌細(xì)胞中上調(diào)并與預(yù)后不良相關(guān)

作為DNA復(fù)制的重要參與者，F(xiàn)EN1可能在癌癥組織中上調(diào)表達(dá)。研究者通過數(shù)據(jù)庫(kù)比較了癌組織和正常組織中FEN1的表達(dá)水平，結(jié)果表明，肺癌組織中FEN1 mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常組織(圖1A)。研究者進(jìn)一步通過免疫組織化學(xué)(IHC)分析比較了正常組織和肺癌樣本中FEN1蛋白的表達(dá)水平，證實(shí)了這一觀察結(jié)果(圖1B)。在正常組織中，F(xiàn)EN1評(píng)分低于100分的患者占85%，這一比例明顯低于癌組織。相反，癌組織中FEN1評(píng)分在200分以上的患者比例明顯高于正常組織。數(shù)據(jù)庫(kù)數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，肺癌的惡性程度隨著FEN1表達(dá)水平的增加而升高(圖1D)，這說明肺癌的惡性程度與FEN1的過度表達(dá)有關(guān)。相應(yīng)地，F(xiàn)EN1水平高的患者總體生存時(shí)間明顯短于FEN1水平低的患者(圖1E)。這些結(jié)果提示FEN1在肺癌中表達(dá)上調(diào)，與腫瘤惡性程度和預(yù)后不良有關(guān)。

圖1

2. FEN1促進(jìn)腫瘤的體內(nèi)外進(jìn)展

本研究選擇A549細(xì)胞作為非小細(xì)胞肺癌藥物代謝研究的體外模型。上述數(shù)據(jù)已經(jīng)表明FEN1的過度表達(dá)與癌癥有關(guān)，但FEN1的高表達(dá)是否會(huì)影響腫瘤進(jìn)展尚不清楚。研究者比較了FEN1被siRNA下調(diào)的A549細(xì)胞的增殖率(圖2A)和FEN1異位過表達(dá)的A549細(xì)胞的增殖率(圖2B)。結(jié)果表明，F(xiàn)EN1的下調(diào)抑制了細(xì)胞生長(zhǎng)(圖2C)，而FEN1的過表達(dá)促進(jìn)了細(xì)胞生長(zhǎng)(圖2D)。集落形成實(shí)驗(yàn)表明，過表達(dá)FEN1誘導(dǎo)了A549細(xì)胞的集落形成(圖2E-F)，而內(nèi)源性FEN1的下調(diào)則降低了A549細(xì)胞的集落形成效率(圖2G)。此外，流式細(xì)胞分析顯示，與對(duì)照細(xì)胞相比，F(xiàn)EN1基因敲除導(dǎo)致S期和G2/M期比例降低，G1期比例增加。將異位FEN1過表達(dá)的細(xì)胞移植到裸鼠皮下后，其腫瘤體積明顯大于親本A549細(xì)胞(圖2H)。這些結(jié)果表明，F(xiàn)EN1促進(jìn)了腫瘤在體內(nèi)和體外的進(jìn)展。

圖2

3. FEN1在A549細(xì)胞順鉑耐藥中的作用

鑒于FEN1在多個(gè)修復(fù)過程中的作用，例如BER、非同源末端連接、HR、NER和錯(cuò)配修復(fù)等，推測(cè)FEN1在腫瘤中的高水平表達(dá)與固有或獲得性耐藥有關(guān)。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究者在不同F(xiàn)EN1水平的A549肺癌細(xì)胞中進(jìn)行了藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，F(xiàn)EN1的過表達(dá)對(duì)順鉑具有保護(hù)作用(圖3A)，同時(shí)，F(xiàn)EN1基因敲除使A549細(xì)胞對(duì)順鉑敏感(圖3B)。為了進(jìn)一步分析FEN1對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，研究者測(cè)定了順鉑處理后的亞G1期細(xì)胞比例。結(jié)果表明，在順鉑作用下，F(xiàn)EN1基因的敲除導(dǎo)致亞G1期細(xì)胞積聚(圖3C)。FEN1的過表達(dá)減少了順鉑誘導(dǎo)的亞G1期片段的產(chǎn)生(圖3D)。TUNEL染色顯示，F(xiàn)EN1基因敲除細(xì)胞在順鉑處理后比對(duì)照細(xì)胞凋亡更多(圖3E，F(xiàn))，而FEN1過表達(dá)細(xì)胞凋亡比對(duì)照細(xì)胞更少(圖3G，H)。這些數(shù)據(jù)表明FEN1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

研究者開發(fā)耐藥細(xì)胞，并設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估克服順鉑耐藥性的可能性。研究者將從A549肺癌細(xì)胞中建立的順鉑耐藥細(xì)胞命名為A549-順鉑-R細(xì)胞或簡(jiǎn)稱為A549-R。使用10和20微升的FEN1抑制劑C20處理A549-R細(xì)胞3天。結(jié)果顯示，A549-R細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性部分喪失。

圖3

4. FEN1表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的A549細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

順鉑所致?lián)p傷的修復(fù)缺陷可導(dǎo)致未修復(fù)的DNA中間體和DNA雙鏈斷裂(DSB)的積聚。因此，研究者預(yù)測(cè)FEN1下調(diào)的細(xì)胞將比對(duì)照細(xì)胞表現(xiàn)出更高水平的DNA雙鏈斷裂。為了驗(yàn)證假設(shè)，研究者確定了細(xì)胞中DNA雙鏈斷裂的標(biāo)志物cH2AX和53BP1的病灶。的確，F(xiàn)EN1的下調(diào)導(dǎo)致了cH2AX(圖4A，B)和53BP1(圖4E，F(xiàn))在細(xì)胞中的積累。相反，F(xiàn)EN1過表達(dá)降低了順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)cH2AX(圖4C，D)和53BP1(圖4G，H)的病灶形成水平。順鉑引起的未修復(fù)DNA損傷的積累將導(dǎo)致染色體斷裂。為了測(cè)試FEN1對(duì)順鉑誘導(dǎo)的染色體斷裂的影響，研究者分析了中期細(xì)胞核的染色體畸變。與對(duì)照親本細(xì)胞相比，F(xiàn)EN1缺陷細(xì)胞的染色體片段和斷裂水平顯著增加(圖4I-J)。然而，高FEN1表達(dá)水平的細(xì)胞顯示染色體斷裂水平降低(圖4K)。

圖4

5. FEN1抑制劑導(dǎo)致未修復(fù)的DSB積聚并增強(qiáng)對(duì)順鉑的敏感性

基于以上結(jié)果，研究者推測(cè)FEN1特異性抑制劑可以作為一種抗癌藥物，既可以單獨(dú)使用來抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，也可以與DNA損傷誘導(dǎo)劑聯(lián)合使用來提高治療效果。研究者使用一種FEN1抑制劑C20驗(yàn)證假設(shè)，為了確定靶向抑制FEN1能否增強(qiáng)順鉑在A549細(xì)胞中的活性，用C20預(yù)處理A549細(xì)胞，然后用不同濃度的順鉑處理48h，圖5A顯示C20處理的細(xì)胞存活率顯著降低。與僅用順鉑處理的細(xì)胞相比，C20和順鉑處理的細(xì)胞顯示出更多的cH2AX和53BP1病灶(圖5B-E)。為了評(píng)價(jià)FEN1抑制劑對(duì)不同F(xiàn)EN1水平細(xì)胞的毒性，研究者還比較了C20在不同肺癌細(xì)胞系中的IC50。結(jié)果顯示A549、H1299和H460細(xì)胞增殖呈劑量依賴性下降，IC50分別為12.5、22.1和20.81M(圖5F)。值得注意的是，F(xiàn)EN1表達(dá)水平低的細(xì)胞對(duì)FEN1抑制劑的敏感性較低。提示FEN1在不同癌細(xì)胞中的表達(dá)可能與其對(duì)FEN1抑制劑的敏感性有關(guān)。

圖5

6. 抑制FEN1對(duì)移植瘤小鼠的抗腫瘤作用

為了進(jìn)一步研究抑制FEN1對(duì)體內(nèi)腫瘤進(jìn)展的影響，研究者用裸鼠進(jìn)行了異種移植研究。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠腫瘤體積以時(shí)間依賴的方式逐漸增大。單獨(dú)使用順鉑或FEN1抑制劑治療后，移植瘤的生長(zhǎng)略有下降（圖6A）。當(dāng)順鉑與FEN1抑制劑聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，腫瘤生長(zhǎng)明顯減少。同時(shí)，聯(lián)合治療組動(dòng)物存活率也有所提高（圖6B）。這些結(jié)果表明，抑制FEN1可以增強(qiáng)順鉑對(duì)小鼠肺癌移植瘤的療效。

圖6

7. FEN1的下調(diào)或抑制激活了細(xì)胞凋亡的內(nèi)在途徑

P53通路是最常見的細(xì)胞凋亡機(jī)制。在應(yīng)激狀態(tài)下，p53被磷酸化后激活，并作為轉(zhuǎn)錄因子激活凋亡相關(guān)基因的表達(dá)。研究者檢測(cè)了FEN1缺乏誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是否依賴于p53，發(fā)現(xiàn)順鉑(圖7A)誘導(dǎo)P53和磷酸化的P53，表明其激活了P53通路。作為p53激活的下游事件，A549細(xì)胞中的凋亡指標(biāo)caspase-3也在順鉑作用下上調(diào)。此外，c-H2AX顯示DNA損傷程度與凋亡指標(biāo)上調(diào)相關(guān)，順鉑可上調(diào)DNA損傷程度(圖7A)。

為了明確DNA損傷是否可以誘導(dǎo)凋亡反應(yīng)，研究者用FEN1 siRNA處理A549細(xì)胞，并檢測(cè)了A549細(xì)胞的凋亡反應(yīng)。結(jié)果顯示，F(xiàn)EN1基因敲除增加了FC-H2AX的水平。同時(shí)，F(xiàn)EN1基因敲除后，磷酸化的p53和caspase-3的表達(dá)也被上調(diào)，這與順鉑處理結(jié)果類似(圖7B)。這些數(shù)據(jù)表明，DNA損傷是由FEN1基因敲除引起的，并可能誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步證實(shí)FEN1和DNA損傷水平在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用，研究者測(cè)定了FEN1過表達(dá)的A549細(xì)胞對(duì)順鉑的反應(yīng)。如圖7C所示，F(xiàn)EN1的過表達(dá)減少了順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷，順鉑誘導(dǎo)的p53活化和caspase-3形成也明顯減少。這一結(jié)果表明，F(xiàn)EN1通過減少細(xì)胞內(nèi)DNA損傷來保護(hù)細(xì)胞免受順鉑誘導(dǎo)的凋亡。

接下來，研究者對(duì)圖6C中的腫瘤進(jìn)行了免疫組化檢測(cè)。結(jié)果如圖7D所示，與caspase-3和TUNEL陽性細(xì)胞處理相比，順鉑和FEN1抑制劑聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞凋亡顯示出更大的協(xié)同作用。此外，c-H2AX和53BP1染色表明，與FEN1抑制劑或順鉑單獨(dú)治療相比，F(xiàn)EN1抑制劑和順鉑聯(lián)合治療可在腫瘤中產(chǎn)生更多的DSB，這與先前的研究結(jié)果一致。綜上所述，上述結(jié)果提示FEN1下調(diào)或抑制激活了p53介導(dǎo)的內(nèi)在凋亡途徑。

圖7