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中文標(biāo)題：人膀胱癌中的MIR516A通過(guò)降低PHLPP2表達(dá)和BECN1依賴性自噬發(fā)揮致癌作用

發(fā)表期刊：Autophagy

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：16.016

發(fā)表時(shí)間：2021年1月

合作單位：溫州醫(yī)科大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看詳情）

● 研究背景

根據(jù)以往報(bào)道，MIR516A在卵巢癌、肺癌、原發(fā)性胃癌和前列腺癌等多種癌癥中下調(diào)，并起到腫瘤抑制作用。但MIR516A和PHLPP2在人類膀胱癌（BC）中的表達(dá)情況和潛在作用仍有待研究。

● 研究結(jié)果

1. MIR516A促進(jìn)體內(nèi)和體外的BC細(xì)胞生長(zhǎng)

qPCR檢測(cè)了MIR516A在新鮮臨床BC組織樣本和人BC細(xì)胞系（TCCSUP、UMUC3、J82和RT112）中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MIR516A在BC樣本中的表達(dá)出乎意料的顯著高于對(duì)照（圖1A，B），這一結(jié)果與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中19對(duì)膀胱癌組織的檢測(cè)結(jié)果一致。體外建立的MIR516A干擾（MIR516Ai）穩(wěn)轉(zhuǎn)株（BC細(xì)胞系：UMUC3和J82）和軟瓊脂實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明抑制MIR516A可以顯著降低BC細(xì)胞的單層生長(zhǎng)（圖1C-E），也會(huì)損害其錨定依賴性生長(zhǎng)（圖1F，G）。

這些結(jié)果表明，MIR516A不僅在人BC組織中過(guò)表達(dá)，而且起致癌作用。在體內(nèi)異種移植裸鼠模型中，注射MIR516A抑制劑減弱了裸鼠BC細(xì)胞的異種移植瘤生長(zhǎng)（圖1H，I），表明MIR516A促進(jìn)體內(nèi)膀胱腫瘤生長(zhǎng)。

圖1

2. MIR516A靶向PHLPP2并下調(diào)其在人BC細(xì)胞中的蛋白水平

TargetScan工具預(yù)測(cè)了MIR516A的可能靶基因ACTG2、ETS2和PHLPP2（圖2A），進(jìn)而在干擾MIR516A的BC細(xì)胞中后檢測(cè)了三者的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)PHLPP2上調(diào)（圖2B）。已知PHLPP2是一種良好的腫瘤抑制因子，因此選定其為研究目標(biāo)。PHLPP2在BC細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)顯著抑制了細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)（圖2C，D）；雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了MIR516A對(duì)PHLPP2 mRNA 3’UTR的調(diào)控（圖2E，F(xiàn)）；qPCR實(shí)驗(yàn)表明MIR516A不影響PHLPP2 mRNA水平（圖2G）（圖2G），預(yù)測(cè)MIR516A可能通過(guò)抑制其蛋白翻譯而下調(diào)PHLPP2。

那么， MIR516A是否通過(guò)PHLPP2影響BC細(xì)胞的錨定依賴性生長(zhǎng)？在MIR516Ai細(xì)胞中繼續(xù)敲低PHLPP2，這增加了細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)（圖2H，I），表明MIR516A誘導(dǎo)的PHLPP2下調(diào)在MIR516A促進(jìn)BC細(xì)胞生長(zhǎng)中起作用。

圖2

3. 抑制MIR516A可誘導(dǎo)BC細(xì)胞自噬并抑制錨定非依賴性生長(zhǎng)

為了研究MIR516A對(duì)BC的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究者在體外BC細(xì)胞（UMUC3和J82）中干擾MIR516A（MIR516Ai），自噬標(biāo)記物L(fēng)C3從LC3-I到LC3-II的轉(zhuǎn)變（圖3A）、LC3點(diǎn)狀聚集物（圖3B-D）和自溶酶體的形成（圖3E，F(xiàn)）表明MIR516A誘導(dǎo)了BC細(xì)胞自噬；而當(dāng)MIR516Ai細(xì)胞繼續(xù)敲除PHLPP2后，這些自噬現(xiàn)象都受到抑制（圖3G-J）。

抑制MIR516A可誘導(dǎo)自噬，所以是自噬導(dǎo)致BC細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的嗎？研究者采用自噬抑制劑BAF處理MIR516Ai細(xì)胞，這導(dǎo)致LC3-II水平的顯著累積（圖3K），并逆轉(zhuǎn)了MIR516Ai對(duì)細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)的抑制（圖3L，M），表明MIR516A抑制人BC細(xì)胞中的自噬，進(jìn)而促進(jìn)BC細(xì)胞生長(zhǎng)。

圖3

4. FBXW7-185aa對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制

MIR516A是否對(duì)自噬相關(guān)蛋白質(zhì)(ATGs)的表達(dá)有影響呢？對(duì)MIR516Ai細(xì)胞中這些蛋白的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，只有BECN1（啟動(dòng)自噬的關(guān)鍵蛋白）上調(diào)了（圖4A，B，再繼續(xù)敲低PHLPP2后，BECN1表達(dá)均減弱了（圖4C），表明BECN1被MIR516A抑制，并可能在MIR516A引起的自噬抑制通路中起作用。接著，他們?cè)谕瑫r(shí)干擾MIR516A和PHLPP2的BC細(xì)胞中過(guò)表達(dá)BECN1，發(fā)現(xiàn)LC3-II轉(zhuǎn)化顯著增加（圖4D），細(xì)胞錨定非依賴性生長(zhǎng)顯著被抑制（圖4E，F(xiàn)）。敲低MIR516Ai細(xì)胞中的內(nèi)源性BECN1（圖4G）降低了LC3-II轉(zhuǎn)化、點(diǎn)狀聚集物形成和自溶酶體形成（圖4H-J），也挽救了MIR516Ai細(xì)胞的錨定非依賴性生長(zhǎng)（圖4K，L）。這些結(jié)果表明，抑制MIR516A導(dǎo)致BECN1上調(diào)，進(jìn)而誘導(dǎo)BC細(xì)胞自噬，且抑制其錨定非依賴性生長(zhǎng)。

圖4

5. MIR516A-PHLPP2通路促進(jìn)了cul4a介導(dǎo)的BECN1蛋白降解

在同時(shí)干擾MIR516A和PHLPP2的BC細(xì)胞中檢測(cè)BECN1 mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)其mRNA沒(méi)有變化（圖5A），但是蛋白降解速率增加（圖5B-D）。此外，MIR516Ai顯著降低了BECN1蛋白的降解速率。之后，作者采用共免疫沉淀（co-IP）和質(zhì)譜鑒定（LC-MS/MS）方法篩選了BECN1的互作蛋白，發(fā)現(xiàn)BECN1的互作蛋白中沒(méi)有PHLPP2，但卻包括E3泛素蛋白連接酶的幾個(gè)核心成分CUL3、CUL4A和CUL4B，并顯示出更高的肽譜匹配數(shù)（圖5E）。據(jù)報(bào)道，CUL3和CUL4可以通過(guò)泛素化介導(dǎo)的蛋白酶體調(diào)節(jié)BECN1蛋白的穩(wěn)定性和降解。因此作者檢測(cè)了MIR516A和PHLPP2對(duì)這些蛋白表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)只有CUL4A蛋白水平有變化（圖5F）。Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)CUL4A和BECN1具有相互作用（圖5G）。CUL4A過(guò)表達(dá)和干擾實(shí)驗(yàn)顯示，CUL4A促進(jìn)BECN1蛋白降解。這些結(jié)果表明，MIR516A-PHLPP2依賴CUL4A促進(jìn)BECN1蛋白降解。

圖5

6. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明MIR516Ai上調(diào)PHLPP2和BECN1，同時(shí)下調(diào)MKI6

體內(nèi)異種移植瘤免疫組化（IHC）實(shí)驗(yàn)顯示，MIR516Ai導(dǎo)致PHLPP2與BECN1表達(dá)上調(diào)、MKI67（癌細(xì)胞增殖標(biāo)志物）陽(yáng)性BC細(xì)胞持續(xù)減少（圖6A-D），并且PHLPP2表達(dá)與BECN1表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.8235，p=0.0013）（圖6E）。

總之，這些結(jié)果表明，MIR516A抑制通過(guò)結(jié)合PHLPP2 mRNA的3′UTR上調(diào)PHLPP2，導(dǎo)致CUL4A介導(dǎo)的BECN1蛋白降解減少，并進(jìn)一步增加BECN1介導(dǎo)的自噬，從而抑制BC生長(zhǎng)（圖6F）。

圖6

● 研究結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)MIR516A在人類膀胱癌（BC）中的作用與在已往報(bào)道的抑癌作用相反，它并非作為BC抑制因子，而是一種促進(jìn)因子。MIR516A在BC組織和細(xì)胞系中顯著上調(diào)，抑制了其靶基因PHLPP2的表達(dá)，進(jìn)而部分促進(jìn)CUL4A介導(dǎo)的BECN1蛋白降解，減少了BC細(xì)胞自噬并促進(jìn)BC生長(zhǎng)。這是首次發(fā)現(xiàn)MIR516A在其他癌癥中未被發(fā)現(xiàn)的獨(dú)特功能。

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