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Wang W.J. et al： Endonuclease G promotes autophagy by suppressing mTOR signaling and activating the DNA damage response

中文標(biāo)題：內(nèi)切酶G通過抑制mTOR信號(hào)傳導(dǎo)和激活DNA損傷反應(yīng)來促進(jìn)自噬

發(fā)表期刊：Nature Communications

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：17.694

發(fā)表時(shí)間：2021年8月

合作單位：暨南大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

研究概述：

內(nèi)切酶G (ENDOG)是一種線粒體核酸酶，已知參與許多細(xì)胞過程，但其在自噬中的作用尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)線粒體釋放的ENDOG促進(jìn)饑餓期間的自噬。通過對(duì)人類細(xì)胞系、小鼠、果蠅和秀麗隱桿線蟲的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這種自噬在物種間是進(jìn)化保守的。在饑餓狀態(tài)下，糖原合成酶激酶3-β介導(dǎo)的ENDOG在Thr-128和Ser-288位點(diǎn)的磷酸化增強(qiáng)了其與14-3-3γ的相互作用，導(dǎo)致14-3-3γ釋放Tuberin (TSC2)和磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基3 (Vps34)，隨后mTOR途徑被抑制并開始自噬。或者，ENDOG通過其內(nèi)切酶活性激活DNA損傷反應(yīng)并引發(fā)自噬。

研究結(jié)果：

1、ENDOG促進(jìn)肝細(xì)胞中的自噬流

先前的研究證明ENDOG同源物CPS-6在秀麗隱桿線蟲受精時(shí)能調(diào)控自噬作用，那么ENDOG是否也能調(diào)控一般自噬呢？在人肝細(xì)胞系（L02和HepG2）中過表達(dá)ENDOG顯著增加了LC3B-II積累，降低了自噬底物SQSTM1表達(dá)，促進(jìn)了自噬體形成（圖1a-d），而干擾ENDOG顯著抑制了許多核心ATG蛋白的表達(dá)和磷酸化。mCherry-GFP-LC3雙熒光指示實(shí)驗(yàn)表明ENDOG過表達(dá)能增強(qiáng)肝細(xì)胞中的自噬流。ENDOG敲除細(xì)胞系在正常和應(yīng)激條件下(饑餓、雷帕霉素和CQ處理)的自溶體形成被顯著抑制（圖1e-m），表明ENDOG促進(jìn)自噬流。

圖1

2、ENDOG缺失抑制了多種物種中饑餓誘導(dǎo)的自噬

接著，研究者進(jìn)一步探索了ENDOG在體內(nèi)能否促進(jìn)自噬以及該功能在不同物種間是否保守。與對(duì)照組相比，ENDOG敲除小鼠在饑餓處理后，其肝臟中的LC3B積累減少，SQSTM1表達(dá)增加，自噬小泡數(shù)量減少（圖2a-d）。饑餓處理后，ENDOG敲低果蠅的脂肪體細(xì)胞中mCherry-Atg8a（LC3同源物）的積累比未敲低組少（圖2e）。在正常和饑餓條件下，秀麗隱桿線蟲中ENDOG同源物cps-6的缺失均顯著降低了GFP的水平（圖2f）；在側(cè)線細(xì)胞和咽肌中，cps-6的缺失抑制了GFP::LGG-1（LC3同源物）點(diǎn)的數(shù)量（圖2g-h）。這些結(jié)果表明，在小鼠、果蠅和秀麗隱桿線蟲中，ENDOG促進(jìn)自噬這一功能是保守的。

圖2

3、ENDOG通過抑制mTOR信號(hào)通路促進(jìn)部分自噬

為了探索ENDOG誘導(dǎo)自噬的機(jī)制，研究者檢測(cè)了mTOR信號(hào)通路（自噬負(fù)調(diào)節(jié)因子）的參與情況。在人正常肝細(xì)胞L02及其他肝癌細(xì)胞系中，ENDOG的缺失都增加了mTOR及其底物的磷酸化水平（圖3a，b）。ENDOG敲除小鼠肝臟中的mTOR及其底物的磷酸化顯著增加（圖3c，d）。當(dāng)使用RHEBQ64L來持續(xù)激活mTOR，發(fā)現(xiàn)其部分恢復(fù)了mTOR活性（圖3e、f），降低了ENDOG過表達(dá)細(xì)胞中LC3B-II的積累和自噬體的形成（圖3e–h）。但在ENDOG過表達(dá)的細(xì)胞中，LC3B-II的積累和自噬體的數(shù)量仍然多于RHEBQ64L過表達(dá)的野生型細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，ENDOG可部分通過抑制mTOR信號(hào)來促進(jìn)自噬。

4、ENDOG通過與14-3-3γ相互作用抑制mTOR通路

隨后，研究人員進(jìn)行了ENDOG的免疫共沉淀和質(zhì)譜（IP-MS）法來進(jìn)一步探索ENDOG通過mTOR促進(jìn)自噬的機(jī)制。他們?cè)谫|(zhì)譜結(jié)果中發(fā)現(xiàn)可以調(diào)控mTOR活性的14-3-3γ。Co-IP WB實(shí)驗(yàn)證實(shí)了14-3-3γ與ENDOG的相互作用。免疫熒光染色表明14-3-3γ與ENDOG共定位。

ENDOG是否影響14-3-3γ與其他自噬相關(guān)蛋白的相互作用呢？CoIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ENDOG的過表達(dá)抑制了TSC2/Vps34和14-3-3γ之間的相互作用（圖3i）。IP WB實(shí)驗(yàn)還表明，饑餓處理略微增強(qiáng)了ENDOG和14-3-3γ之間的內(nèi)源性相互作用，而削弱了TSC2/Vps34與14-3-3γ的相互作用（圖3j）。過表達(dá)14-3-3γ能重新激活mTOR途徑，減少LC3B-II的積累和SQSTM1的降解，并減少ENDOG過表達(dá)細(xì)胞中自噬體的形成（圖3k–m）。這些結(jié)果表明，ENDOG與14-3-3γ競爭性結(jié)合，使14-3-3γ釋放TSC2（mTOR的負(fù)調(diào)節(jié)因子）和Vps34，抑制mTOR通路并啟動(dòng)自噬。

圖3

5、GSK-3β介導(dǎo)的ENDOG磷酸化增強(qiáng)了其與14-3-3γ的相互作用

已知14-3-3蛋白主要通過與靶蛋白的一般共有序列RXXpS/TXP結(jié)合而起磷酸化作用，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)ENDOG的T128和S288磷酸化可能分別與14-3-3γ的S59和E18形成氫鍵。因此，將ENDOG的T128和S288進(jìn)行突變，T128/S288變?yōu)锳128/A288、T128/S288變?yōu)镈128/D288，以模擬非活性（AA）和活性形式（DD）。Co IP結(jié)果表明AA形式抑制了ENDOG和14-3-3γ之間的相互作用，DD形式增強(qiáng)了這種相互作用（圖4a，b）。而單獨(dú)的突變對(duì)它們的相互作用沒有影響。與野生型ENDOG和ENDOG-DD相比，ENDOG-AA在BafA1處理下的自噬體數(shù)量和LC3B-II積累較少（圖4c、d），且不能再抑制mTOR通路來促進(jìn)LC3B-II積累和SQSTM1降解（圖4e，f）。此外，ENDOG在T128和S288的雙重磷酸化對(duì)于其與14-3-3γ的相互作用和自噬的誘導(dǎo)是必要的。

預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)激酶AKT和GSK-3β可能磷酸化ENDOG的T128和S288。然而實(shí)驗(yàn)表明，AKT過表達(dá)顯著降低了ENDOG磷酸化，GSK-3β過表達(dá)顯著增加了ENDOG磷酸化（圖4g，h），增強(qiáng)了ENDOG和14-3-3γ之間的相互作用（圖4g，h），但引入ENDOG的非活性形式（AA）后，這種作用被消除（圖4i，j）。體外磷酸化實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了GSK-3β磷酸化ENDOG（圖4k）。

圖4

6、ENDOG通過激活DNA損傷反應(yīng)促進(jìn)自噬

RHEBQ64L處理后ENDOG誘導(dǎo)的自噬僅部分恢復(fù)，推斷ENDOG促進(jìn)的自噬中可能存在額外的途徑。DNA損傷反應(yīng)是饑餓過程中的早期事件，由PARP-1/AMPK或ATM/CHK2途徑介導(dǎo)，在自噬中起著重要作用。實(shí)驗(yàn)表明，ENDOG的缺失顯著抑制了饑餓誘導(dǎo)的DNA損傷（圖5a-e）。ENDOG敲除抑制了正常條件下PARP-1的表達(dá)和激活，阻斷了饑餓誘導(dǎo)的AMPK激活和mTOR抑制（圖5f，g），抑制了CHK1和CHK2的激活，從而抑制自噬（圖5h，i）。結(jié)果表明ENDOG誘導(dǎo)的DNA損傷可能促進(jìn)饑餓過程中的自噬。

圖5

那么阻斷DNA損傷反應(yīng)是否可以抑制ENDOG誘導(dǎo)的自噬呢？實(shí)驗(yàn)表明， ENDOG增強(qiáng)了依托泊苷誘導(dǎo)的DNA損傷（圖6a-c）。同時(shí)，ENDOG敲除顯著抑制了DNA損傷反應(yīng)（增加了p-H2A.X和p-ATM表達(dá)）（圖6d，e）。此外，依托泊苷處理的ENDOG敲除細(xì)胞的p-H2A.X顯著減少，并且在恢復(fù)期p-H2A.X的減少更快（圖6f，g）。這些數(shù)據(jù)表明ENDOG增強(qiáng)了DNA損傷反應(yīng)。使用ATM特異性抑制劑KU-60019阻斷DNA損傷反應(yīng)后，ENDOG誘導(dǎo)的DNA損傷、LC3BII積累、p-H2A.X水平和自噬體的數(shù)量顯著降低（圖6h-k）。但在KU60019的處理下，ENDOG過表達(dá)細(xì)胞仍然具有更多的p-H2A.X。這些數(shù)據(jù)表明，ENDOG還可以通過激活DNA損傷反應(yīng)來誘導(dǎo)自噬。

圖6

6、ENDOG的核酸內(nèi)切酶活性對(duì)自噬誘導(dǎo)至關(guān)重要

之后，研究者構(gòu)建了各種突變體來確定ENDOG的哪個(gè)結(jié)構(gòu)域?qū)NA損傷和自噬誘導(dǎo)至關(guān)重要（圖7a），將這些突變體過表達(dá)到ENDOG敲除細(xì)胞中，并用依托泊苷處理。與野生型、Del 1-48（刪除線粒體靶向序列）和ENDOG NLS（用核定位序列取代線粒體靶向序列）相比，EM ENDOG（突變氨基酸以消除其內(nèi)切酶活性)過表達(dá)細(xì)胞中的p-mTOR、p-ULK1、p-p70S6K和SQSTM1表達(dá)更高，表明EM ENDOG失去了抑制mTOR活性和自噬促進(jìn)的能力（圖7b，c）。除了EM形式，野生型和這些突變體在ENDOG敲除細(xì)胞中的過表達(dá)都影響了自噬流（圖7d、e）。彗星試驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了ENDOG核酸內(nèi)切酶活性對(duì)誘導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)和自噬至關(guān)重要。

先前的研究表明，caspase-8可裂解并激活Bid，而Bid介導(dǎo)ENDOG從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)，最終轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，導(dǎo)致染色質(zhì)凝聚和DNA斷裂。為了探究caspase-8/Bid是否與本研究情況有關(guān)，研究者進(jìn)一步試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，caspase-8/Bid有助于線粒體釋放ENDOG，可能進(jìn)一步促進(jìn)自噬。

圖7