中文標(biāo)題:LINC00173通過刺激鼻咽癌中RAB1B介導(dǎo)的PA2G4和SDF4的分泌促進(jìn)腫瘤進(jìn)展
發(fā)表期刊:Molecular Oncology
中科院分區(qū):2區(qū)
影響因子:7.449
發(fā)表時間:2023年1月
合作單位:中山大學(xué)腫瘤防治中心
運(yùn)用技術(shù):LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定,RNA pull down(由輝駿生物提供技術(shù)支持,點擊查看服務(wù)詳情)
鼻咽癌(NPC)中超過70%的患者最初被診斷為局部晚期疾病,約20%的鼻咽癌患者在治療后出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部復(fù)發(fā)的情況。急需探索NPC進(jìn)展的機(jī)制,以確定NPC患者的有效治療靶點。長非編碼RNA(lncRNA)沒有編碼蛋白質(zhì)功能,但可以作為其他生物分子的信號、誘餌、引物或支架,構(gòu)成一個巨大而精細(xì)的調(diào)節(jié)系統(tǒng)。之前的微陣列篩選顯示,LINC00173在NPC組織中顯著上調(diào),本研究進(jìn)一步確定了LINC00173的作用機(jī)制。
基于之前的微陣列數(shù)據(jù)(GSE126683),研究者篩選發(fā)現(xiàn)了在鼻咽癌組織中顯著上調(diào)的LINC00173(圖1A),并通過qPCR實驗驗證了這一結(jié)果(圖1B)。此外,LINC00173在NPC細(xì)胞系中的表達(dá)也顯著高于正常鼻咽上皮細(xì)胞系NP69(圖1C)。Kaplan-Meier生存率分析顯示, LINC00173高表達(dá)的患者總生存期、無病生存期和遠(yuǎn)端無轉(zhuǎn)移生存期較差(圖1D-F)。通過單變量和多變量Cox回歸分析,發(fā)現(xiàn)LINC00173的表達(dá)水平和TNM分期是顯著且獨立的預(yù)后決定因素,研究者將LINC00173的表達(dá)水平與TNM分期相結(jié)合,構(gòu)建了一個綜合預(yù)后模型,將NPC患者分為三組。Kaplan-Meier曲線分析發(fā)現(xiàn),這些組的總生存期、無病生存期和遠(yuǎn)端無轉(zhuǎn)移生存期存在顯著差異。這些結(jié)果說明,LINC00173在NPC的預(yù)后方面具有重要價值(圖1G-I)。
圖1
接著,研究者通過敲除和過表達(dá)LINC00173來研究其在NPC中失調(diào)的生物學(xué)功能,發(fā)現(xiàn)敲除LINC00173嚴(yán)重阻礙了細(xì)胞增殖和克隆形成能力(圖2A,B),過表達(dá)LINC00173則有相反效果(圖2C,D)。此外,敲除LINC00173顯著削弱了細(xì)胞的遷移和侵襲能力(圖2E),而過表達(dá)LINC00173則增強(qiáng)了細(xì)胞的遷徙和侵襲能力(2F)。這些結(jié)果表明,LINC00173促進(jìn)NPC的細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移,這可能是導(dǎo)致預(yù)后不良的原因。
圖2
為了研究LINC00173的作用機(jī)制,研究者用生物素標(biāo)記的LINC00173正義或反義序列(0173 SS或AS)進(jìn)行了RNA pull down和質(zhì)譜檢測(LC-MS/MS),尋找LINC00173的互作蛋白。pull down產(chǎn)物的SDS-PAGE銀染結(jié)果顯示有特異性蛋白條帶,質(zhì)譜也檢測到了RAB1B蛋白(圖3A)。RNA pull down WB實驗驗證并確定了LINC00173和RAB1B在NPC細(xì)胞中存在高度相互作用(圖3B)。之后進(jìn)行的RIP qPCR實驗也觀察到LINC00173明顯富集(圖3C,D)。核質(zhì)RNA提取檢測發(fā)現(xiàn)LINC00173主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖3E)。進(jìn)一步的FISH和免疫熒光(IF)分析發(fā)現(xiàn),LINC00173和RAB1B蛋白在細(xì)胞質(zhì)中共定位(圖3F),并且LINC00173的敲除或過表達(dá)都不會影響RAB1B的mRNA或蛋白質(zhì)水平(圖3G,H)。這些發(fā)現(xiàn)表明LINC00173不會影響RAB1B的表達(dá),可能直接與細(xì)胞質(zhì)中的RAB1B蛋白相互作用。
圖3
RAB1B作為RAB蛋白家族的一員,可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)。為了研究LINC00173是否通過調(diào)節(jié)RAB1B介導(dǎo)的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)過程發(fā)揮作用,研究者用質(zhì)譜方法篩選了受LINC00173/RAB1B影響的分泌蛋白。當(dāng)SUNE1細(xì)胞穩(wěn)定干擾LINC00173后,為其更換無血清培養(yǎng)基,16h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析(圖4A),在篩選到的10個差異蛋白(圖4B)中,PA2G4和SDF4差異最大,并且在LINC00173敲除后顯著下降(圖4C)。之后,研究者分別對細(xì)胞裂解物和濃縮上清液中的RAB1B、PA2G4、SDF4蛋白進(jìn)行了Western-blot檢測,發(fā)現(xiàn)LINC00173敲除并不影響細(xì)胞裂解物中的RAB1B、PA2G4和SDF4蛋白水平,而顯著降低了細(xì)胞上清液中的PA2G4和SDF4水平(圖4D)。那么LINC00173/RABB是否通過胞外途徑調(diào)節(jié)PA2G4和SDF4蛋白的分泌呢?研究者用胞外途徑化學(xué)抑制劑Exo-1處理NPC細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PA2G4和SDF4水平顯著下降了(圖4E),表明LINC00173/RABB通過胞外途徑促進(jìn)PA2G4或SDF4的分泌。接著,研究者將RAB1B過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到穩(wěn)定干擾LINC00173的NPC細(xì)胞株中,RAB1B的過表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)PA2G4和SDF4蛋白分泌水平(圖4F)。這些結(jié)果確定了LINC00173可以通過RAB1B介導(dǎo)的胞外途徑中刺激PA2G4和SDF4的分泌。
圖4
LINC00173/RABB是否通過促進(jìn)PA2G4和SDF4蛋白分泌來促進(jìn)NPC的惡性進(jìn)展呢?研究者將LINC00173過表達(dá)質(zhì)粒與PA2G4-shRNA或SDF4-shRNA質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到NPC細(xì)胞中,生長曲線和克隆形成實驗結(jié)果顯示,敲低PA2G4或SDF4顯著逆轉(zhuǎn)了LINC00173過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞生長和增殖作用(圖5A-D)。此外,過表達(dá)LINC00173顯著增加了細(xì)胞的遷移和侵襲能力,敲低PA2G4或SDF4后細(xì)胞侵襲能力減弱(圖5E-F)。這些數(shù)據(jù)表明,LINC00173可以通過促進(jìn)PA2G4和SDF4的分泌來促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
圖5
接下來,研究者利用皮下腫瘤生長模型進(jìn)一步分析LINC00173在NPC體內(nèi)生長和轉(zhuǎn)移中的作用。結(jié)果顯示,敲低LINC00173顯著延緩了腫瘤的生長,與對照組相比,腫瘤的體積、大小和重量都減少了(圖6A-C)。接著,研究者建立腹股溝淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型,并通過尾靜脈注射建立肺轉(zhuǎn)移模型。結(jié)果顯示,敲低LINC00173的腹股溝淋巴結(jié)較小、體積減?。▓D6D-F)。腫瘤H&E染色表明,敲低LINC00173的腫瘤侵襲性較低,對皮膚或肌肉的侵襲能力減弱(圖6G),淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率明顯低于對照組(圖6H,I)。此外,在肺轉(zhuǎn)移模型中,LINC00173基因敲低組在肺表面表現(xiàn)出較小的結(jié)節(jié)(圖6J),轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)較對照組明顯減少和縮小(圖6K,L)。
圖6
本研究確定了LINC00173在鼻咽癌中上調(diào),并與預(yù)后不良相關(guān),通過RNA pull down實驗篩選并驗證了LINC00173的互作蛋白RAB1B,闡明了LINC00173通過RAB1B的胞外轉(zhuǎn)運(yùn)功能,促進(jìn)PA2G4或SDF4分泌,在體內(nèi)和體外促進(jìn)NPC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。
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