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中文標(biāo)題：香蕉果實(shí)成熟過程中淀粉降解過程的綜合研究及轉(zhuǎn)錄激活劑MabHLH6的鑒定

發(fā)表期刊：Plant Biotechnology Journal

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：13.263

時間：2018年1月

合作單位：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

運(yùn)用技術(shù)：itraq蛋白質(zhì)組學(xué)分析（由輝駿生物提供技術(shù)支持，點(diǎn)擊查看服務(wù)詳情）

● 研究背景

淀粉是高等植物的主要儲存碳水化合物，由葡萄糖聚合物、直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，在質(zhì)體中形成復(fù)雜的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)和淀粉顆粒。雖然淀粉降解在擬南芥葉片和谷類種子等模式系統(tǒng)中已經(jīng)得到了很好的研究，但淀粉類水果，特別是香蕉成熟過程中的這一過程還很不清楚。一般來說，香蕉是在成熟的綠色期采收，然后在上市前由乙烯或乙烯釋放化合物啟動成熟。在成熟過程中，果皮顏色從綠色變?yōu)辄S色，果肉變軟。到目前為止，已經(jīng)報(bào)道了幾個與香蕉成熟過程中淀粉到糖的轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因，但對其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的全面了解還不夠深入，尤其是轉(zhuǎn)錄因子(TF)介導(dǎo)的調(diào)控機(jī)制。

● 研究結(jié)果

1.     三種不同成熟行為香蕉成熟參數(shù)的變化

首先，研究者測定了香蕉果實(shí)在自然成熟、乙烯誘導(dǎo)和1-甲基環(huán)丙烯(1-MCP)延遲成熟條件下的乙烯生成量和果實(shí)硬度等重要成熟參數(shù)(圖1A)。結(jié)果如圖1B所示，自然成熟果實(shí)貯藏15天后乙烯釋放量顯著增加，第18天達(dá)到最大值，之后下降；果實(shí)硬度在貯藏第18天開始下降，第23天達(dá)到最低值。乙烯處理促進(jìn)了香蕉果實(shí)的成熟，表現(xiàn)為第1天乙烯產(chǎn)生提前，第3天果肉硬度急劇下降。相比之下，1-MCP處理延緩了香蕉果實(shí)的成熟和乙烯產(chǎn)生，果肉硬度下降，乙烯產(chǎn)量在第30天達(dá)到峰值(圖1B)。香蕉果實(shí)成熟過程中淀粉向糖的轉(zhuǎn)化與不可食向可食的轉(zhuǎn)化有關(guān)，麥芽糖和葡萄糖是淀粉降解的產(chǎn)物，自然成熟果實(shí)的淀粉含量到第15天下降，到第23天下降到4%，可溶性糖含量相應(yīng)增加(圖1B)。在乙烯處理和1-MCP處理的果實(shí)中，淀粉含量的下降和可溶性糖(麥芽糖和葡萄糖)的增加表現(xiàn)出與它們的成熟行為相似的模式(圖1B)。這些數(shù)據(jù)表明，淀粉到糖的轉(zhuǎn)化與香蕉成熟過程中果實(shí)的軟化和乙烯的產(chǎn)生是一致的。

圖1

2. 香蕉生果和熟果中淀粉粒的形態(tài)

圖2顯示的掃描電子顯微鏡(SEM)分析表明，未熟和成熟香蕉果實(shí)中淀粉粒的形狀和大小有明顯的差異。青香蕉的淀粉顆粒表面光滑(圖2C-E)，而成熟香蕉的淀粉顆粒表面有明顯的平行凹槽，表明淀粉降解(圖2H-J)。

圖2

3. 香蕉果實(shí)成熟過程中淀粉降解相關(guān)基因在果肉中的表達(dá)模式

研究者基于香蕉基因組序列和NCBI數(shù)據(jù)庫共鑒定了38個編碼淀粉降解相關(guān)酶的基因，這些基因包括編碼葡聚糖水雙激酶(MaGWD1、MaGWD2、和 MaPWD1）、磷酸葡聚糖磷酸酶(MaSEX4、MaLSF1和MaLSF2)、β-淀粉酶(MaBAM1-MaBAM11)、α-葡聚糖磷酸化酶(MaPHS1和MaPHS2)、歧化酶(MaDPE1和MaDPE2)、麥芽糖過量蛋白(MaMEX1和MaMEX2)和質(zhì)體葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MapGlcT1、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2、MapGlcT4-1和MapGlcT4-2)。

研究中首次報(bào)道了15個基因，包括MaGWD1、MaGWD2、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaDPE1、MaDPE2、MaMEX1、MaMEX2、MapGlcT1、MapGlcT2-1、MapGlcT2-2、MapGlcT4-1和MapG1CT4-2。如圖3所示，在三個不同處理的成熟過程中，27個基因(MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaBAM1MaBAM4、MaBAM6-MaBAM8、MaBAM10、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3、MaPHS2、MaMEX1、MaMEHS2)的轉(zhuǎn)錄本隨著乙烯產(chǎn)量的增加而顯著增加。而MaGWD2、MaAMY2A、MaBAM9、MaPHS1、MaDPE1、MaDPE2和MapGlcT1的轉(zhuǎn)錄本減少。

圖3

4. ITRAQ鑒定淀粉顆粒表面結(jié)合的淀粉降解相關(guān)蛋白及其積累

為了檢測香蕉成熟過程中淀粉粒結(jié)合蛋白的變化，研究者從未成熟和成熟香蕉果實(shí)的淀粉粒中分離出淀粉粒結(jié)合蛋白(圖4A)，然后使用iTRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖4B所示，在淀粉顆粒表面鑒定出18個與淀粉降解相關(guān)的候選蛋白。其中，除MaGWD2和MaPHS1外，MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaBAM4、MaBAM7、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3和MaISA3在成熟果實(shí)中的積累與其轉(zhuǎn)錄本水平相當(dāng)。MaAMY2A、MaISA1、MaDPE1和MaDPE2表達(dá)下調(diào)，而MaGWD2、MaLSF2、MaISA2和MaPHS1表達(dá)變化不大。據(jù)報(bào)道，AtGWD1在擬南芥葉片的短暫淀粉降解中起重要作用，因此選擇AtGWD1的同源物進(jìn)行進(jìn)一步研究。WB分析結(jié)果(圖5B)表明，在香蕉的成熟階段，天然的、乙烯誘導(dǎo)的或1-MCP誘導(dǎo)的延遲成熟都能顯著誘導(dǎo)MaGWD1蛋白的表達(dá)(圖5C)。

圖4

圖5

5. AMaGWD1啟動子相互作用蛋白MabHLH6的鑒定

為了研究MaGWD1的潛在調(diào)控作用，研究者分離了MaGWD1啟動子，并用GUS報(bào)告基因(圖6A)進(jìn)行了瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在MaGWD1啟動子驅(qū)動下轉(zhuǎn)染GUS報(bào)告基因的香蕉果肉中，在乙烯處理的果肉中觀察到GUS信號(圖6B)。然后以MaGWD1啟動子為誘餌，進(jìn)行酵母單雜交文庫篩選。經(jīng)過高精度篩選，獲得了一個編碼bHLHTF的基因，命名為MabHLH6(XP_009408340.1)，。酵母單雜交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了MabHLH6和MaGWD1啟動子之間的相互作用(圖6C，D)。

圖6

6. MabHLH6的分子表征

與MaGWD1相似，MabHLH6的表達(dá)與淀粉降解和果實(shí)成熟呈顯著正相關(guān)，在天然香蕉、乙烯誘導(dǎo)香蕉和1-MCP延遲成熟香蕉中，MabHLH6的表達(dá)水平分別在第18天、第5天和第40天達(dá)到最高水平(圖7A)。同時，其啟動子活性在瞬時表達(dá)實(shí)驗(yàn)中被乙烯誘導(dǎo)(圖7B)。此外，WB分析結(jié)果(圖7C)顯示，MabHLH6蛋白在成熟階段也增加，與果肉硬度和淀粉含量的下降相平行(圖7D)。

圖7

7. MabHLH6通過直接與其啟動子結(jié)合來激活編碼淀粉降解相關(guān)酶的基因的表達(dá)

眾所周知，bHLH轉(zhuǎn)錄因子優(yōu)先與其目標(biāo)啟動子的E-box(CANNTG)基序結(jié)合。為了測試MabHLH6調(diào)節(jié)啟動子(MaGWD1、MaPWD1、MaSEX4、MaLSF1、MaLSF2、MaBAM1-MaBAM4、MaBAM6-MaBAM8、MaBAM10、MaAMY2B、MaAMY2C、MaAMY3、MaAMY3A、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3、MaPHS2、MaMEX1、MaMEX2、MapGlcT2-1、MapGlcT22、MapGlcT2-1）等的能力，研究者進(jìn)行了瞬時檢測。在這些分析中，在淀粉降解相關(guān)基因啟動子的控制下與LUC報(bào)告質(zhì)粒以及在CaMV 35S啟動子控制下攜帶MabHLH6的過表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)化煙草葉片(圖8A)。如圖8C所示，在26個啟動子中，MabHLHH6能顯著誘導(dǎo)MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2啟動子的活性，且Luc/Ren比值相對較高。

圖8

為了進(jìn)一步研究MabHLH6是否與MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2啟動子直接結(jié)合，研究者進(jìn)行了電泳遷移率改變分析(EMSA)。如圖9A，B所示，重組的MabHLH6蛋白能夠與這11個啟動子片段結(jié)合，并引起遷移率的移動。ChIP-qPCR分析進(jìn)一步證實(shí)了MabHLH6與這些啟動子在活體中的結(jié)合。如預(yù)期的那樣，與陰性對照IgG相比，含有MaGWD1、MaLSF2、MaBAM1、MaBAM2、MaBAM8、MaBAM10、MaAMY3、MaAMY3C、MaISA2、MaISA3和MapGlcT2-2啟動子E-box的啟動子區(qū)域顯著富集(圖9C，D)。這些數(shù)據(jù)表明，MabHLH6可能通過直接與其啟動子的E-box基序結(jié)合，作為淀粉降解相關(guān)基因的一個子集的正轉(zhuǎn)錄激活因子。

圖9