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中文標題：泛素特異性蛋白酶3(USP3)通過與SUZ12相互作用和去泛素化促進胃癌細胞遷移和侵襲

發(fā)表期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

中科院分區(qū)：1區(qū)

影響因子：12.658

發(fā)表時間：2019年

合作單位：深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

運用技術：iTRAQ蛋白質組學分析（由輝駿生物提供技術支持，點擊查看服務詳情）

● 研究背景

泛素特異性蛋白酶3(USP3)是一種去泛素化酶，在多種生物學過程中發(fā)揮著重要作用。USP3的異常表達可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。然而，有關USP3促進胃癌轉移的研究仍然少之又少，因此，了解USP3促進胃癌轉移的有關機制將為胃癌的治療提供新的選擇。

● 研究結果

1. 胃癌患者USP3表達增高與腫瘤進展及預后不良相關

為了確定USP3在胃癌侵襲性中的作用，研究者用Western blotting分析了6對胃癌組織中USP3的表達水平。結果表明，USP3在胃癌組織中的表達與鄰近的非腫瘤組織相比有顯著差異(圖1A)。RT-PCR法檢測USP3在6種癌細胞中的表達，結果顯示，與人胃上皮細胞系GES-1相比，GC細胞株AGS、BGC-823、HGC-27和SGC-7901顯示USP3表達增加，而MGC-803和MKN28則沒有顯示出USP3表達增加（圖1B）。應用組織芯片技術(TMA)分析了87例胃癌組織中USP3的表達，結果顯示人胃癌組織的免疫染色較強，而正常胃組織的免疫染色較少(圖1C)。臨床病理分析顯示，USP3的表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、腫瘤大小、T分期、臨床TNM分期呈正相關。Kaplan-Meier法也顯示USP3高表達的胃癌患者的總體存活率明顯低于低USP3表達的患者(圖1E)。這些結果表明，USP3可能在胃癌的發(fā)生發(fā)展中起作用。

圖1

2. USP3上調(diào)促進胃癌EMT轉移

細胞遷移和侵襲能力增加與癌細胞轉移潛能增加有關，而與細胞增殖率無關研究者利用Transwell和劃痕實驗研究了USP3對MGC-803(低表達)以及AGS和BGC-823(高表達)細胞株侵襲和遷移能力的影響（圖2B）。結果表明，與載體對照細胞相比，USP3的異位表達促進了GC細胞的侵襲和遷移(圖2A-C)。此外，與MGC-803細胞相比，AGS和BGC-823細胞表現(xiàn)出更高的侵襲和遷移率(圖2A-C)。接下來，研究者合成了3對USP3 siRNA，結果顯示USP3的敲除可以抑制AGS和BGC-823細胞的侵襲和遷移能力(圖2D，E)。這表明USP3的高表達可能通過促進胃癌細胞的侵襲和遷移能力而參與胃癌的轉移。研究者還研究了GC細胞的形態(tài)特征。觀察顯示轉染USP3的細胞發(fā)生了顯著的形態(tài)變化，呈現(xiàn)出EMT過程中產(chǎn)生的成纖維細胞的典型特征(圖2F)。免疫熒光和WB分析顯示，上皮標志物E-cadherin在USP3轉染細胞中的表達顯著降低，而間充質標志物vientin(與EMT呈正相關)在USP3轉染細胞中的表達顯著上調(diào)(圖2G，H)。一些研究表明，參與Erk1/2/Akt信號轉導的磷酸化水平蛋白已成為EMT的中心特征，在許多腫瘤模型中，EMT是腫瘤轉移的初始步驟。為此，研究者進行了WB實驗以分析蛋白質的磷酸化狀態(tài)。結果顯示，在USP3過表達的細胞中，AKT和ERK1/2的磷酸化水平升高，而p-AKT和ERK1/2的水平降低了siRNA介導的USP3在GC細胞中的下調(diào)。這些結果表明，USP3的過表達可能通過誘導EMT過程促進胃癌的侵襲和轉移。

圖2

3. Usp3在TGF-β1誘導的胃癌細胞內(nèi)皮細胞轉化和細胞遷移中的作用

已有報道表明，TGF-β可誘導胃癌細胞發(fā)生內(nèi)胚層轉化。為了研究TGF-β是否影響USP3的表達，研究者首先檢測了TGF-β處理的BCG-823細胞中USP3的表達水平。結果顯示，TGF-β處理后USP3的表達顯著增加，且呈劑量和時間依賴性。此外，TGF-β1顯著抑制EMT標志物Ecadherin的表達。然而，用USP3 siRNA預先轉染細胞不僅抑制了USP3的表達，也抑制了TGF-β1誘導的vimentin 的表達。這些結果表明，USP3參與了TGF-β誘導的EMT過程。

4. USP3促進EMT和體內(nèi)轉移

通過裸鼠尾靜脈注射實驗觀察USP3對胃癌轉移的影響，與對照細胞相比，USP3過表達細胞組在肺部形成了各種大的轉移結節(jié)(圖3A)，侵襲能力也顯著增強(圖3B)。組織學分析證實BGC-823細胞存在肺轉移(圖3C)。qPCR分析結果顯示，與對照細胞相比，USP3過表達的細胞導致E-cadherin的表達顯著降低(圖3D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3的異位表達參與了胃癌細胞的EMT過程和轉移的調(diào)控。

圖3

5. USP3對胃癌細胞SUZ12蛋白表達的影響

研究者通過iTRAQ實驗分析了穩(wěn)定表達FLAG-USP3融合蛋白的BGC-823細胞和攜帶空載體的BGC-823細胞的總蛋白。鑒定出5631種蛋白質用于進一步的定量分析。其中，當USP3基因異位表達時，SUZ12表達上調(diào)。qPCR分析表明，USP3的過表達或敲除均對SUZ12的mRNA水平?jīng)]有影響(圖4A)。然而，USP3上調(diào)時內(nèi)源性SUZ12表達增加(圖4B)，USP3降低時內(nèi)源性SUZ12表達減少(圖4C)，這表明USP3對SUZ12表達的調(diào)控只發(fā)生在轉錄后水平。激光共聚焦掃描顯微鏡觀察了USP3和SUZ12的定位，結果顯示這兩種蛋白在GC細胞中定位于相同的區(qū)域，它們主要分布在細胞核，少量分布在細胞質中(圖4D)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3應該是胃癌細胞中SUZ12的一個強有力的調(diào)節(jié)因子。

圖4

6. USP3與SUZ12相互作用并使其去泛素化

研究者將USP3和Myc標記的SUZ12載體共轉染GC細胞，以闡明USP3對SUZ12的作用機制。結果顯示，F(xiàn)LAG標記的USP3可以與Myc標記的SUZ12在GC細胞中免疫共沉淀(圖5A)。CoIP實驗進一步表明，USP3可以與SUZ12相互作用(圖5B)。為了解決USP3是否以及如何穩(wěn)定SUZ12的問題，研究者用放線菌酮處理了vector和表達USP3的BCG-823細胞(圖5C)。結果表明，USP3通過抑制蛋白質降解提高了SUZ12的穩(wěn)定性。在BCG-823細胞中轉染FLAG標記的USP3或空載體質粒，WB分析顯示，USP3的表達強烈地抑制了SUZ12的泛素化(圖5D)，而抑制USP3的表達則導致了相反的結果(圖5E)。這些發(fā)現(xiàn)表明，USP3是一個通過與SUZ12相互作用和去泛素化來控制SUZ12蛋白水平的DUB。

圖5

7. SUZ12參與USP3誘導的GC細胞遷移、侵襲和EMT

為了探討USP3、SUZ12與細胞遷移和侵襲能力的關系，研究者通過siRNA 下調(diào)了SUZ12在GC細胞中的表達(圖6A)。結果表明，轉染SUZ12 siRNA 的GC細胞的遷移和侵襲能力顯著減弱(圖6B，C)。研究者進一步研究了SUZ12是否通過調(diào)節(jié)USP3的表達來影響EMT過程。在顯微鏡下，在USP3細胞中敲除SUZ12后恢復了正常的表型(圖6D)。采用IHC法檢測淋巴結轉移組織中USP3和SUZ12的表達，發(fā)現(xiàn)USP3和SUZ12在兩例患者癌細胞的胞核和胞漿中高表達(圖6E)。此外，WB分析結果表明，在USP3過表達的細胞中，SUZ12的敲除增加了上皮標志物Ecadherin的表達，但降低了間質標志物vientin、Snail和MMP9的表達(圖6F)。這些數(shù)據(jù)表明，USP3-SUZ12軸促進了GC細胞的EMT樣表型。

圖6

8. USP3和SUZ12在胃癌細胞和癌組織中的表達呈正相關

為了進一步研究USP3和SUZ12之間的關系，研究者分析了USP3和SUZ12在胃癌細胞和組織中的表達。結果表明，大多數(shù)GC細胞中USP3和SUZ12的蛋白水平呈正相關(圖7A)。免疫組織化學染色顯示，USP3和SUZ12陽性信號在10例胃癌標本的癌細胞中均呈強陽性或中等陽性表達(圖7B)。癌組織和正常胃組織中USP3和SUZ12的表達譜與上皮標志物E-cadherin的表達譜呈負相關(圖7B)。此外，Spearman等級相關分析證實，USP3蛋白與SUZ12蛋白在人體組織中的表達呈正相關(圖7C)，USP3和SUZ12蛋白水平與Ecadherin蛋白水平呈負相關(圖7D)。這些結果表明，USP3和SUZ12的表達水平呈正相關，USP3/SUZ12和E-cadherin蛋白的表達水平呈負相關。

圖7