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背景：
強(qiáng)制性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC（OSKM）可將體細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSC)。在重編程開(kāi)始時(shí)，外源OSKM與整個(gè)基因組的DNA結(jié)合，并誘導(dǎo)連續(xù)幾輪染色質(zhì)重組，從而激活整個(gè)多能性基因網(wǎng)絡(luò)。然而，OSKM不是孤立運(yùn)作的，需要與共同的調(diào)節(jié)者(共激活因子和共抑制因子)合作來(lái)有效重塑表觀遺傳環(huán)境，但這種相互作用是如何調(diào)節(jié)的，目前仍知之甚少。

內(nèi)容概述：
2018年6月，中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院再生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在國(guó)際期刊Nature Cell Biology（IF₂₀₁₇=19.064）上發(fā)表了題為“NCoR/SMRT co-repressors cooperate with c-MYC to create an epigenetic barrier to somatic cell reprogramming“的最新論文，首次發(fā)現(xiàn)NCoR/SMRT共抑制子通過(guò)其核心表觀遺傳亞基“組蛋白去乙?；?(HDAC3) ”，去除基因組多能基因位點(diǎn)上的“活性標(biāo)記”H3K27ac，從而抑制四個(gè)山中因子(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)介導(dǎo)的重新編程。此外，山中因子中的c-MYC可以募集NCoR/SMRT-HDAC3到基因組位點(diǎn)，有助于解釋“為什么包含c-MYC的重編程體系更容易產(chǎn)生不完全重編程”的現(xiàn)象。本研究不僅揭示了NCoR/SMRT共抑制子在重編程中的作用，而且提出了c-MYC在這一過(guò)程中的雙重功能。

主要技術(shù)：
RNA-seq、ChIP、Co-IP、基因過(guò)表達(dá)/干擾等；
輝駿生物為本研究提供了蛋白檢測(cè)和分析服務(wù)。

研究路線：

研究結(jié)果：
1. NCoR/SMRT抑制OSKM重編程
首先，研究者首先發(fā)現(xiàn)Ncor1(編碼NCoR)和Ncor2(編碼SMRT)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)、胚胎干細(xì)胞(ESC)和OSKM重編程細(xì)胞中均有表達(dá)。無(wú)論用怎樣的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法、報(bào)告系統(tǒng)、MEF類型或培養(yǎng)基，抑制Ncor1/2的表達(dá)都能增強(qiáng)OSKM誘導(dǎo)的重編程(圖1a-c)。

RNA-seq發(fā)現(xiàn)Ncor1/2敲除細(xì)胞在OSKM重編程時(shí)的基因表達(dá)譜很相似(圖1e)，但Ncor2敲除的整體效應(yīng)更強(qiáng)(圖1e)。許多體細(xì)胞基因在OSKM 第5天上調(diào)，在第9天變得不明顯(圖1f)，而與間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)都沒(méi)有受到影響。OSKM第9天出現(xiàn)了多能基因的上調(diào)。這些結(jié)果表明，在OSKM重編程中敲除Ncor1/2先是暫時(shí)減弱了對(duì)體細(xì)胞基因的抑制，接著是加快和更有效地激活多能性基因。

 
2. NCoR/SMRT共抑制因子需要HDAC3來(lái)破壞重新編程
NCoR和SMRT可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾因子（如組蛋白脫乙酰酶HDAC）調(diào)控染色質(zhì)。泛HDAC抑制劑（VPA和TSA）能促進(jìn)重編程，因此推測(cè)HDAC可能參與NCoR/SMRT抑制OSKM重編程的過(guò)程。據(jù)報(bào)道，HDAC1、2、3、4、5、7都能與NCoR/SMRT相互作用，因此研究人員全面檢測(cè)了HDAC1到HDAC11在MEF、ESC和OSKM重編程細(xì)胞中的表達(dá)：HDAC1到HDAC6在三類細(xì)胞中都有表達(dá)(圖2a)。接著，他們研究了敲除HDAC的效果，發(fā)現(xiàn)只有HDAC3敲除顯著促進(jìn)了重編程 (圖2b)。此外，VPA的加入不影響HDAC3敲除細(xì)胞的重編程(圖2c)，表明泛HDAC抑制劑通過(guò)抑制HDAC3促進(jìn)OSKM重編程。接下來(lái)，研究者制備了2個(gè)HDAC3突變體HDAC3-YF（缺乏去乙酰酶活性）和HDAC3-YF-KA（既缺乏去乙酰酶活性，也缺乏結(jié)合NCoR/SMRT的能力）(圖2d)；同時(shí)以HDAC1-YF和HDAC2-YF做對(duì)照。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)HDAC3-YF顯著增強(qiáng)了OSKM重編程(圖2e)；VPA不影響HDAC3-YF重編程的程度(圖2f)；HDAC3-YF-KA突變體不再促進(jìn)重編程，表明HDAC3-YF需要結(jié)合NCoR/SMRT來(lái)發(fā)揮作用 (圖2d，e)。另外，HDAC3-YF過(guò)表達(dá)細(xì)胞重編程的第9和13天（尤其是第13天），許多多能基因的表達(dá)都升。

這些結(jié)果表明，HDAC3介導(dǎo)的NCoR/SMRT對(duì)OSKM重編程的抑制需要去乙酰酶活性；但是抑制NCoR/SMRT或HDAC3對(duì)體細(xì)胞基因的影響不同，這可能是由于靶位點(diǎn)上NCoR/SMRT的缺失影響了其他酶的活性，或是招募了一些激活因子。

3. HDAC3通過(guò)誘導(dǎo)多能基因位點(diǎn)的組蛋白去乙酰化來(lái)抑制重編程
接著，研究者發(fā)現(xiàn)組蛋白H3乙酰化(AcH3)和組蛋白H4乙?；?AcH4)在ESC中的水平均高于MEF(圖3a)；在VPA或TSA增強(qiáng)的OSKM重編程細(xì)胞中，其水平也均有增加(圖3b)，但是在NCoR/SMRT缺失或HDAC3-YF過(guò)表達(dá)的OSKM重編程細(xì)胞中，它們的水平?jīng)]有增加，另外受NCoR/SMRT-HDAC3調(diào)控的代表性的乙?；M蛋白H3K27ac和H4K12ac的水平也沒(méi)有增加(圖3c，d)。

接著，HDAC3-YF誘導(dǎo)OSKM重編程的細(xì)胞進(jìn)行了H3K27ac 的ChIP-seq實(shí)驗(yàn)，研究組蛋白乙?；恼w影響(圖3e)。結(jié)果顯示，大多數(shù)H3K27ac位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)附近。之后的檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，H3K27ac水平較高的多為多能性相關(guān)基因(圖3f)；在重編程后期，4個(gè)多能基因座（Sall4、Utf1、Nanog和Zic2）都表現(xiàn)出H3K27ac的增加(圖3g)，H3K27ac的ChIP-qPCR驗(yàn)證了這一結(jié)果(圖3h)；在重編程的第9天，HDAC3-YF 的ChIP-qPCR(圖3i)也發(fā)現(xiàn)這些基因座被顯著富集了(圖3i)，表明HDAC3-YF過(guò)表達(dá)直接影響OSKM重編程中H3K27ac的水平，H3K27ac的水平與這些多能基因的水平呈相關(guān)性(圖3j)。

綜上所述，HDAC3可能作為NCoR/SMRT復(fù)合體的一部分，使特定基因位點(diǎn)（如多能基因位點(diǎn)）發(fā)生組蛋白去乙?；?，從而抑制OSKM重編程。

 
4. NCoR/SMRT通過(guò)HDAC3介導(dǎo)的組蛋白去乙?；种贫嗄苄曰蚣せ?/strong>
研究者對(duì)OSKM重編程細(xì)胞進(jìn)行了NCoR/SMRT的CHIP Seq實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在ESC和重編程細(xì)胞中，NCoR與SMRT的結(jié)合峰有很多重疊的(圖4a，b)，這些峰大多位于TSS附近，這與H3K27ac的ChIP-seq數(shù)據(jù)一致。GO分析顯示，重編程特有的結(jié)合峰或重編程與ESC細(xì)胞共有的結(jié)合峰，大多與干細(xì)胞相關(guān)(圖4c)，例如多能性基因Sox2和Prdm4僅在重編程細(xì)胞中與NCoR/SMRT結(jié)合，且這些基因座的H3K27ac水平在重編程中比ESC中更低(圖4d)，與之前認(rèn)為NCoR/SMRT通過(guò)HDAC3去乙?；淖饔脕?lái)抑制重編程的結(jié)論相符。ChIP-qPCR證實(shí)了在重編程時(shí)NCoR/SMRT與Nanog和Utf1啟動(dòng)子結(jié)合，而在ESC中的結(jié)合較少(圖4e)，在MEF中幾乎不能結(jié)合。ESC特有的NCoR/SMRT結(jié)合峰，大多與分化相關(guān)(圖4c)，但敲除NCoR/SMRT并不能誘導(dǎo)分化。

這些結(jié)果表明，NCoR/SMRT被招募到多能基因位點(diǎn)抑制重編程，但在ESC中，它們具有不同的功能，這可能與發(fā)育過(guò)程中的組織特異性有關(guān)。

 
重編程中NCoR/SMRT的招募與H3K27ac水平呈反相關(guān)，在重編程為多能細(xì)胞時(shí)伴隨著H3K27ac水平的升高。為了確定這一發(fā)現(xiàn)是否適用于所有的NCoR/SMRT結(jié)合基因，以及HDAC3-YF過(guò)表達(dá)是否有助于增加NCoR/SMRT靶位點(diǎn)的H3K27ac水平，他們?cè)贖DAC3-YF/空載誘導(dǎo)重編程細(xì)胞以及ESC細(xì)胞中，檢測(cè)了NCoR/SMRT靶位點(diǎn)的H3K27ac水平，發(fā)現(xiàn)重編程第5天的H3K27ac水平較低，在第13天最高(圖5a-d)，其中HDAC3-YF過(guò)表達(dá)組上調(diào)更明顯；另外ESC中的H3K27ac水平也較高。之后，他們對(duì)NCoR/SMRT結(jié)合的一組多能基因在TSS的2kb范圍內(nèi)進(jìn)行了qPCR。發(fā)現(xiàn)無(wú)論過(guò)表達(dá)HDAC3-YF或敲除Ncor1/2時(shí)，重編程過(guò)程中H3K27ac水平的升高與多能基因表達(dá)的增加均有很好的相關(guān)性(圖5e)。這些結(jié)果證實(shí)了NCoR/SMRT通過(guò)HDAC3介導(dǎo)的組蛋白去乙酰化來(lái)抑制多能性基因的激活。

 
5. c-MYC在重編程時(shí)招募了NCoR/SMRT-HDAC3復(fù)合體    
外源OSKM因子可能參與了NCoR/SMRT-HDAC3與特定基因位點(diǎn)的結(jié)合。HEK293T細(xì)胞的免疫共沉淀（Co-IP）證實(shí)了OSKM4個(gè)因子均與NCoR/SMRT相互作用，其中c-MYC的結(jié)合更強(qiáng)（圖6a）；NCoR/SMRT的N端結(jié)構(gòu)域是c-MYC-NCoR/SMRT相互作用所必需的 (圖6b，c)。CoIP實(shí)驗(yàn)表明，NCoR/SMRT的N端結(jié)構(gòu)域可以共沉淀c-MYC和內(nèi)源性的HDAC3 (圖6d)，外源性c-MYC可以共沉淀內(nèi)源性的HDAC3(圖6e)，說(shuō)明HDAC3可以和c-MYC-NCoR/SMRT相互作用。ChIP-seq分析發(fā)現(xiàn)，NCoR/SMRT中還存在著一個(gè)c-MYC結(jié)合基序(圖6f)。此外，NCoR1/2基因敲除未能提高OSK的重編程效率(圖6g)，HDAC3-YF的表達(dá)對(duì)OSK的重編程也沒(méi)有有利影響(圖6h)；NCoR/SMRT的ChIP–qPCR表明，Nanog和Utf1位點(diǎn)在OSK誘導(dǎo)的重編程中不能被富集(圖6i)。

 
根據(jù)NCoR/SMRT的ChIP-seq數(shù)據(jù)及其GEO庫(kù)下載的（OSKM四因子在pre-iPSCs, 48h OSKM重編程和ESC細(xì)胞的）ChIP–seq數(shù)據(jù)，研究者分析了NCoR/SMRT和OSKM四因子的結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)性(圖7a)，在pre-iPSCs中，NCoR/SMRT與c-MYC的結(jié)合位點(diǎn)重疊最高，其次是KLF4和OCT4/SOX2(圖7b，c)，其中KLF4重疊位點(diǎn)大部分也與c-MYC結(jié)合 (圖7d)，說(shuō)明c-MYC可能招募了NCoR/SMRT到這些位點(diǎn)。在48h OSKM重編程細(xì)胞中，NCoR/SMRT與OCT4、SOX2和c-MYC的結(jié)合位點(diǎn)都有大概60-70%的重疊，并且這些位點(diǎn)大部分是三因子共有的（圖7e-g）。86%的c-MYC重疊位點(diǎn)在iPSCs中也存在，說(shuō)明c-myc在重編程早期招募了NCoR/SMRT到這些位點(diǎn)，GO富集分析顯示，這些位點(diǎn)基因富集在干細(xì)胞或囊胚相關(guān)的條目里。相反，9天OSKM重編程和ESCs中的NCoR/SMRT結(jié)合位點(diǎn)與ESCs中c-MYC（或OSK）的沒(méi)有太多重疊，說(shuō)明NCoR/SMRT在重編程和ESCs中具有不同的功能。
綜上，在四個(gè)山中因子中，c-MYC最有助于將NCoR/SMRT募集到基因組位點(diǎn)（包括多能性位點(diǎn)），從而對(duì)重編程產(chǎn)生負(fù)面影響。

 
6. 外源c-MYC在重編程中的雙重作用
為了進(jìn)一步評(píng)估c-MYC和NCoR/SMRT在重編程中抑制多能基因的作用關(guān)系，研究者制備了由Oct4末端增強(qiáng)子(Oct4-DE)驅(qū)動(dòng)的DsRed報(bào)告基因慢病毒 (圖8a)并整合到細(xì)胞基因組，發(fā)現(xiàn)OCT4、SOX2或KLF4在MEF中的單獨(dú)過(guò)表達(dá)略微激活了報(bào)告因子，但它們的組合具有協(xié)同作用(圖8b，c)。相比之下，c-MYC單獨(dú)沒(méi)有激活作用，但與OSK結(jié)合使用會(huì)削弱報(bào)告基因活性的增加(圖8b，c)，Ncor1/2的敲除部分緩解了c-MYC對(duì)報(bào)告基因的抑制(圖8b)，這些結(jié)果表明，c-MYC募集NCoR/SMRT共抑制子到多能基因位點(diǎn)將不利于重編程，但這與之前的研究OSKM可誘導(dǎo)重編程的結(jié)論不一致。因此，研究者進(jìn)一步用OSK和多西環(huán)素誘導(dǎo)的c-MYC重編程MEF(圖8d)。c-MYC誘導(dǎo)的第3-9天，干細(xì)胞標(biāo)記物堿性磷酸酶陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)量達(dá)到峰值，不會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增加（圖8e）。c-MYC誘導(dǎo)后第3-9天Oct4-GFP+細(xì)胞數(shù)量也達(dá)到高峰，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)明顯減少(圖8f)；相反，OSK三因子的誘導(dǎo)在重編程的所有階段都是有益的。這些結(jié)果表明，外源性c-MYC通過(guò)招募NCoR/SMRT-HDAC3抑制多能基因?qū)χ鼐幊掏砥谑遣焕摹?/span>

結(jié)論：
本研究發(fā)現(xiàn)NCoR/SMRT–HDAC3共抑制復(fù)合物通過(guò)與OSKM因子（尤其是c-MYC）相互作用為重編程制造障礙，這一發(fā)現(xiàn)揭示了c-MYC在重編程中的雙重作用，也有助于解釋為何用OSKM而非OSK誘導(dǎo)重編程更容易產(chǎn)生pre-iPSCs，以及為何用HDAC抑制劑對(duì)OSKM而非OSK誘導(dǎo)的重編程能產(chǎn)生更強(qiáng)的效果等問(wèn)題。